Sous-expression in planta des 4 TmNAC par ARN interférence (RNAi)

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Détermination de la teneur en protéines : Les grains restants de chaque maître brin ont été

broyés en farine complète à l’aide d’un broyeur et de billes métalliques. Le contenu total en

azote (exprimé en pourcentage de masse de farine) a été mesuré pour 5 mg de chaque

échantillon selon la méthode de combustion de Dumas modifiée (méthode AOAC n°992.23) à

l’aide d’un analyseur FlashEA 1112N/Protein analyzer (Thermo Scientific). Chaque mouture a

été analysée en duplicat. Le contenu total en protéines a été estimé en multipliant le contenu

total en azote par 5,7 (Sosulski et Imafidon 1990). La valeur en pourcentage peut être ramenée

à une masse de protéines en la multipliant par le poids du grain considéré, ce qui a permis de

calculer :

- le pourcentage de protéines du grain,

- la quantité de protéines du grain,

- la quantité de protéines du maître brin entier.

5.5.2. Sous-expression in planta des 4 TmNAC par ARN interférence (RNAi)

Pour compléter les informations obtenues par le phénotypage de plantes sur-exprimant les 4

TmNAC, nous avons produit en parallèle des plantes transgéniques sous-exprimant ces gènes.

5.5.2.1. Principe

L’ARN interférence est une technique basée sur la dégradation post-transcriptionnelle

séquence-spécifique d’ARN messagers dans le cytoplasme, suite à l’introduction d’ARN

double brin dans l’organisme transformé.

Pour éteindre l’expression d’un gène de manière spécifique, une construction est créée à partir

d’une portion de sa séquence codante insérée 2 fois, tête-bêche, dans un plasmide qui est ensuite

inséré de manière non-ciblée dans le génome de l’organisme. La transcription de cette séquence

par la cellule produit des ARN double-brin avec une structure en épingle à cheveux et

homologues à la séquence du gène ciblé. L’organisme identifie les ARN double brin formés

comme des produits aberrants et les dégrade en séquences de 21 à 24 nucléotides, ainsi que tous

les ARN du gène ciblé possédant la même séquence (Figure 40).

Figure 41 : Structure des cassettes utilisées pour l’ARN interférence. Une portion de 156 pb

de la séquence codante de TmNAC1, TmNAC2, TmNAC3, TmNAC4 et TaNAC5 est clonée en

orientation sens et anti-sens dans un plasmide pSTARGATE. Dans un cas, ces portions sont

cumulées les unes à la suite des autres dans le but d’obtenir des plantes sous-exprimant tous

les gènes et d’autre part, ces portions sont co-bombardées pour obtenir des embryons sous

-exprimant des combinaisons différentes de gènes, à des niveaux variables. Une cassette de

sélection est co-bombardée avec cette cassette RNAi, à un ratio molaire de 2:1 en faveur de la

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Cependant, cette dégradation n’est pas forcément totale, et l’ARN interférence permet de

générer des plantes transgéniques présentant un taux d’extinction variable, très utile lorsque

l’extinction complète du gène est létale pour l’organisme (Travella et al. 2006 ; Fu et al. 2007).

De plus, la diminution de l’expression du gène est persistante à travers les divisions cellulaires

et peut être transmise aux générations suivantes.

Le point clé pour la réussite d’une validation fonctionnelle par ARN interférence chez le blé

tendre est que la portion du gène insérée dans la cassette RNAi doit produire des séquences 21

nucléotides spécifiques du gène ciblé et uniquement de celui-ci, afin de ne pas entrainer

l’extinction d’autres gènes (off-target) (Fu et al. 2007). Ceci peut poser problème dans le cas

de grandes familles de gènes aux séquences très proches.

5.5.2.2. Construction des cassettes de transformation RNAi

Lors de la construction des cassettes RNAi (2015), les données disponibles sur la plateforme

Genevestigator ont révélé l’existence d’un gène chez le blé tendre présentant un profil

d’expression spécifique au grain et identique aux 4 NAC suivis. Nous l’avons baptisé TaNAC5.

L’amplification PCR de ce gène chez le petit épeautre a été un échec. Toutefois, afin qu’aucun

phénomène de compensation de fonction physiologique lié à la présence d’un gène similaire

aux 4 TmNAC n’opère, la séquence du blé tendre de ce gène a été ajoutée pour la création des

constructions d’extinction.

Ainsi, 2 types de plantes RNAi ont donc été générés (Figure 41) :

- une première série d’embryons immatures a été bombardée avec un mélange des 5 cassettes

contenant la construction « Promoteur Ubiquitine – Séquence RNAi de TmNAC sens –

Intron espaceur - Séquence RNAi de TmNAC anti-sens – Terminateur NOS » construites

pour TmNAC1, TmNAC2, TmNAC3, TmNAC4 et TaNAC5, ainsi que la cassette de

sélection contenant le gène PMI. Les lignées régénérées de ce co-bombardement

d’embryons auront intégré entre une et 5 des cassettes RNAi en plus de la cassette de

sélection, et par ségrégation, devraient donner un panel de plantes transgéniques ayant

une combinaison variée de gènes TmNAC sous-exprimés,

- une deuxième série d’embryons immatures a été bombardée par une cassette contenant les

séquences RNAi des 4 TmNAC et de TaNAC5 à la suite, tête-bêche, encadrées par le

Figure 42 : Le vecteur pSTARGATE. Le promoteur Ubiquitine permet une forte expression de

la cassette chez les monocotylédones transformées. L’insertion de la séquence d’intérêt en sens

et anti-sens a lieu via une recombinaison LR aux sites de recombinaisons attR1 et attR2. Le

terminateur du gène NOS (NOpaline Synthase) marque la fin de la cassette d’expression. La

séquence intronique permet un repliement du transcrit en épingle à cheveux, puis elle est

excisée. L’enzyme Dicer reconnait ces ARN double brin et les clive en petits ARN de 21

nucléotides. Ceux-ci vont permettre au complexe RISC de reconnaître et dégrader les transcrits

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même promoteur ubiquitine et le terminateur NOS ; ainsi que par la cassette contenant le

gène de sélection PromUbi – PMI. Les lignées régénérées de ce bombardement

d’embryons devraient donc sous-exprimer les 5 NAC et éviter tout phénomène de

compensation entre eux au cours du développement du grain de blé.

Contrairement à la surexpression, les cassettes RNAi contenant les portions RNAi des gènes

NAC et la cassette contenant le gène de sélection PMI ne sont pas physiquement liées. Ceci

engendre un nombre plus important de faux positifs (des plantes croissant sur le milieu sélectif

sans posséder la cassette RNAi). Afin de contrebalancer cela, la cassette ou le mix des cassettes

RNAi et la cassette de sélection ont été mélangées selon un ratio molaire de 2:1 avant d’être

bombardé, pour favoriser l’insertion de la/des séquence(s) RNAi.

Des fragments de 156 pb de la séquence codante de chacun des 5 NAC ont été choisis sur la

base de la spécificité de tous les tronçons de 21 nucléotides, encadrés par des AttL1 et AttL2

permettant le clonage Gateway, et synthétisé par la société Proteogenix dans le vecteur donneur

pUC57.

5.5.2.3. Le vecteur receveur pSTARGATE

Un clonage par réaction LR (technologie Gateway) a été réalisé dans le plasmide pSTARGATE,

qui possède 2 sites d’insertion de la cassette, en orientation sens et anti-sens situés entre un

promoteur ubiquitine et un terminateur NOS. Entre ces 2 sites d’insertion se trouve une

séquence intronique issue du génome d’Arabidopsis, qui aide à la formation de la structure

ARN double-brin en épingle à cheveu (Smith et al. 2000).

La recombinaison s’effectue entre le pUC57 et un vecteur de destination Gateway, le

pSTARGATE adapté, fourni par le CSIRO selon la technologie Gateway (LR) (Australie ;

http://www.pi.csiro.au/rnai/vectors.htm; Figure 42, Figure 43), qui a ensuite été utilisé pour

transformer des cellules compétentes E. coli DH5α comme décrit en Matériel & Méthode –

Partie 3.3.3. Le vecteur recombinant a ensuite été digéré par l’enzyme de restriction NotI et la

cassette a été purifiée par migration sur gel suivie de lavages au butanol et à l’éther (protocole

confidentiel – propriété de l’INRA). Des embryons immatures de petit épeautre ont été

transformés par biolistique avec un mélange de ces cassettes et les plantules T0 ont été

régénérées, comme précédemment mentionné en Matériel & Méthode – Partie 5.5.1.

Figure 43 : Schéma global des étapes successives de la validation fonctionnelle par

sous-expression. La séquence RNAi de chacun des 4 TaNAC a été clonée dans le vecteur receveur

pSTARGATE par la technologie Gateway.

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5.5.2.4. Génotypage et suivi de l’expression des plantes transformées

Les plantes transformées T0 ont été génotypées pour la présence de la cassette par PCR sur

ADN génomique, à l’aide de 2 couples d’amorces amplifiant une partie de la séquence

intronique d’Arabidopsis. Dans les plantes T1, la présence d’une ou plusieurs cassettes

d’expression et l’identification de ces cassettes ont été étudiées par RT-qPCR à l’aide de

couples d’amorces ciblant spécifiquement chaque cassette utilisée, dans les mêmes conditions

que décrit en Matériel & Méthode – Partie 3.2.4. Les amorces sont décrites dans l’Annexe I.

Seules les plantes transformées avec la cassette cumulant les 5 TmNAC ont été étudiées en

génération T2. Elles étaient peu nombreuses et ont donc été étudiées uniquement en conditions

thermique contrôle (19°C). Le niveau d’expression des gènes dans les plantes transgéniques et

Null-Ségrégant a été suivi par RT-qPCR sur ARN totaux de grain (cf. Matériel & Méthode –

Partie 3), en utilisant les mêmes amorces que pour l’étude des plantes de surexpression. Leur

phénotypage a été identique à celui réalisé sur les plantes sur-exprimant TmNAC2 ou

TmNAC4.

6. Significativité des différences statistiques observées dans les lignées transgéniques et

Dans le document Analyse des facteurs de transcription de la famille NAC chez le blé tendre (Triticum aestivum L.) et leur implication dans la réponse à des stress abiotiques (Page 174-180)