Transformation transitoire de feuilles de tabac

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3.3.4. Extraction d’ADN plasmidique par lyse alcaline (mini prep)

L’ADN plasmidique a été extrait à partir de cultures bactériennes liquides par la méthode de

lyse alcaline (Sambrook et al. 2001), qui a pour avantage d’éliminer l’ADN du chromosome

bactérien (Protocole détaillé en Annexe III). Une fois extrait, l’ADN plasmidique a été dosé au

spectrophotomètre (Nanodrop®) et sur gel d’agarose 1% par évaluation visuelle de l’intensité

des bandes en comparaison avec une échelle quantitative (1 kb DNA Ladder).

3.3.5. Séquençage

La séquence exacte de l’insert a été obtenue par séquençage de type Sanger sur les ADN

plasmidiques extraits par lyse alcaline. Ce séquençage a été réalisé par l’entreprise Beckman

Coulter Genomics (Takeley, Royaume Uni), sur un minimum de 3 clones différents pour

chaque couple d’amorce.

4. Transformation transitoire de feuilles de tabac

Cette expérimentation a pour but d’étudier la localisation des protéines TaNAC au sein de la

cellule végétale. La Figure 27 en synthétise les grandes étapes.

4.1. Clonage du gène dans le vecteur pEarleyGate104 (pEG104)

4.1.1. Le plasmide pEG104

Les séquences entières des gènes d’intérêt ont été clonées par une ligation Gateway de type LR

dans un vecteur de destination, ici le vecteur binaire pEarleyGate 104 (pEG104). Ce plasmide,

décrit par Earley et al. (2006), est utilisé pour la transformation des cellules végétales par le

système Agrobacterium tumefaciens. Son site de clonage de type Gateway permet l’insertion

du gène d’intérêt en position C-terminale de la protéine fluorescente YFP (Yellow Fluorescent

Protein). La séquence de la protéine de fusion YFP + ADNc ainsi créée est sous le contrôle du

promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur. Cette cassette d’expression est bordée

Figure 28: Le vecteur binaire pEG104 (pEarley Gate 104). Ce plasmide permet de produire

une protéine chimère constituée d’un fluorochrome accolé à la partie N-terminale de la

protéine étudiée, sous le contrôle du promoteur 35S. Cette cassette d’expression est encadrée

par des zones de bordure (LB à gauche et RB à droite) qui permettent son intégration dans le

génome des cellules de tabac. Le vecteur possède aussi un site de clonage de type Gateway, un

gène de résistance à la kanamycine, et 2 origines de réplication, l’une pour E. coli et l’autre

pour A.tumefaciens.

Figure 29 : Principe du clonage d’un gène d’intérêt par recombinaison homologue

(Technologie Gateway, Invitrogen). Le clonage de la séquence dans un vecteur de destination

contenant les sites attL1 et attL2 par une recombinaison LR permet l’obtention d’un clone

d’expression. Le gène ccdB est toxique pour les bactéries E. coli et permet de sélectionner

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son excision du plasmide. La région est bornée par les bordures LB (Left Border) et RB (Right

Border) responsables de l’intégration d’ADN exogène chez les plantes. Ce plasmide comporte

aussi 2 origines de réplication, l’une fonctionnelle dans E. coli et l’autre dans A. tumefasciens,

et un gène de résistance à la kanamycine (Figure 28).

4.1.2. Clonage de type Gateway

Le clonage de type Gateway (Figure 29) est un clonage par recombinaison homologue entre le

vecteur donneur et le vecteur de destination. La ligation Gateway de type LR est réalisée à l’aide

d’une enzyme LR Clonase (Invitrogen) selon les recommandations du fournisseur. Elle permet

une recombinaison entre des sites attL1 et attL2 d’un clone d’entrée et attR1 et attR2 d’un

vecteur de destination, permettant l’échange de 2 inserts (la cassette d’intérêt vs le gène létal

ccdB). À la fin de la ligation, le vecteur d'expression contient des sites attB et le gène d’intérêt

qui est prêt à être traduit.

4.2. Transformation d’Agrobacterium tumefaciens

4.2.1. Souche d’A. tumefaciens utilisée

La souche d’A. tumefaciens GV3101 (Flückiger et al. 2003) a été utilisée pour la transformation

transitoire de feuilles de tabac et l'analyse de la localisation in planta de protéines chimères

fusionnées au chromophore YFP. Cette souche porte un plasmide Ti qui code pour les gènes de

virulence permettant le transfert et l’intégration de l’ADN-T dans le génome végétal, et un gène

de résistance à la gentamycine.

4.2.2. Mise en compétence et transformation de la souche

Une pré-culture d’A. tumefaciens est diluée dans 150 ml de milieu LB. Après une incubation

de 3-4 heures en agitation à 28°C (DO600 = 0,5), les bactéries en phase exponentielle de

croissance sont centrifugées 20 min à 3000g et 4°C. Le culot bactérien est ensuite lavé dans 10

ml de tampon TE froid (Tris pH8 100 mM ; EDTA 1 mM) puis ressuspendu dans 20 ml de

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milieu LB. Des aliquots de 500 μl sont utilisés directement pour la transformation ou congelés

dans l’azote liquide puis stockés à -80°C.

La méthode de transformation utilisée est une adaptation du protocole décrit par Höfgen et

Willmitzer (1988). Pour la transformation, 200 μl d’agrobactéries compétentes sont mélangées

avec 1 à 5 μg d’ADN plasmidique, puis le choc thermique suivant est réalisé : 5 min dans la

glace, 5 min dans l’azote liquide et 5 min à 37°C. La suspension bactérienne est ensuite diluée

dans 1 ml de milieu LB puis placée à 28°C sous agitation (180 rotations par minute) durant

3-4 heures. Un aliquot de 200 μl est alors étalé sur une boîte de milieu LB gélosé complémenté

en kanamycine (100 μg/ml, dont la résistance est introduite par le vecteur pEG104) et en

gentamycine (25 μg/ml, dont la résistance est portée par le plasmide Ti présent dans les souches

GV301). Après 2 jours d’incubation à 28°C, des colonies isolées sont prélevées sur la boite de

Petri et mises en culture liquide pour la transformation de cellules végétales.

4.3. Infiltration de l’épiderme inférieur de feuilles de tabac (Nicotiana tabacum)

Afin d’étudier l’expression transitoire de protéines chimères et déterminer la localisation

subcellulaire de ces protéines, des plants de tabac Nicotiana tabacum cv. Samsun-NN ont été

cultivés en chambre de culture pendant 4-5 semaines à 24°C (16h de lumière / 8h d'obscurité)

pour être transformés par agro-infiltration au stade 5 feuilles.

L'infiltration par l’agrobactérieGV3101 s’effectue sur l'épiderme inférieur de feuilles de tabac.

Les colonies d'agrobactéries transformées sont mises en culture dans du LB à 28°C pendant

16h, puis 1 ml de culture est centrifugé 3 min à 5500 g. Le culot est lavé 2 fois dans 1 ml d’eau

et centrifugé à 5500 g pendant 20 min. Les agrobactéries sont ensuite reprises dans de l’eau

pour une densité optique comprise entre 0,5 et 0,8 à 600 nm. La suspension est laissée 3h à

température ambiante, puis infiltrée dans les feuilles de tabac par simple pression d’une

seringue de 1 ml sans aiguille sur l'épiderme inférieur légèrement griffé des feuilles.

4.4. Observations en microscopie à épifluorescence

Après 2-3 jours, la fluorescence est observée dans les feuilles exprimant les protéines chimères

en utilisant un microscope optique à épifluorescence (Carl Zeiss Axioplan 2 imaging

Figure 30 : Cinétique de développement du grain de petit épeautre. Comme pour le blé, le

développement du grain de petit épeautre peut être divisé en 3 phases : division cellulaire,

remplissage des cellules en réserves et maturation-dessiccation du grain. Les chiffres indiquent

les stades de développement, exprimés en °Cj (degrés Celsius jour). Les étoiles représentent les

8 stades de prélèvement (0, 40, 80, 120, 180, 220, 300 et 700°Cj après anthèse) réalisés pour

le suivi de l’expression des gènes TmNAC (photos : D. Marcon).

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fluorescence microscope). Celui-ci est équipé d’un système d’acquisition (caméra

AxiocamMR) couplé au logiciel de traitement d’images Axiovision. Une lampe UV et un bloc

filtre permettent la détection des fluorochromes. Le filtre FITC permet de visualiser l’YFP qui

a un pic d’excitation à 514 nm et un pic d’émission à 527 nm.

Dans le document Analyse des facteurs de transcription de la famille NAC chez le blé tendre (Triticum aestivum L.) et leur implication dans la réponse à des stress abiotiques (Page 146-152)