Utilisation d’aptamères comme agents de capture, de purification ou de séparation de protéines séparation de protéines

Drolet et ses collaborateurs ont été les premiers à présenter une étude concernant l’utilisation d’aptamères en série ADN immobilisés comme phase stationnaire d’affinité

[254]. Un aptamère de 36 nucléotides, spécifique et hautement affin (Kd = 2 nM) [241] pour la L-sélectine humaine, a été utilisé pour la purification chromatographique d’un récepteur recombinant, la L-sélectine-globuline (LS-Rg), une protéine de fusion formée du domaine extracellulaire de la L-sélectine humaine fusionnée à l’amine terminale de la chaîne lourde de l’IgG1 humaine, à partir de cellules ovariennes de hamsters (CHO). L’extrémité 5’ biotinylée de l’aptamère ADN anti-L-sélectine a été immobilisée au niveau d’un support sépharose-streptavidine. Après injection sur cette colonne d’affinité, la protéine de fusion est éluée dans des conditions qui ne dénaturent pas les protéines, en se basant sur l’influence des cations divalents sur les structures tertiaires des aptamères. Ainsi, un gradient d’EDTA (Acide Ethylène-Diamine-Tétraacétique) est utilisé pour libérer la protéine capturée. Cette étude a montré une bonne efficacité des aptamères comme ligands d’affinité pour la purification de protéines (pureté de 63% avec un rendement de 83% ; facteur de purification de 1500 en une seule étape).

Doyle et ses collaborateurs ont également publié la purification par affinité du facteur de transcription 1 de la thyroïde (TTF1) en utilisant un aptamère hautement spécifique et affin, immobilisé sur des billes magnétiques [263]. La chromatographie d’affinité a été réalisée en une seule étape de purification à partir d’un mélange de protéines, présent dans la fraction soluble d’un lysat de bactéries. L’élution de la protéine TFF1 à partir de la matrice d’affinité a été menée en utilisant un traitement par des DNases recombinantes. Le rendement des protéines TFF1 purifiées est de 25-50 %.

Plus récemment, un aptamère ADN, fixant la thrombine, a été utilisé comme système de capture de protéines en chromatographie capillaire d’affinité [264]. Un aptamère de 15 nucléotides de long, modifié en 5’ par un thiol, a été attaché de façon covalente à la surface interne d’un capillaire de silice fondue par l’intermédiaire d’un lien organique. Après capture de la protéine par une incubation pendant une nuit à 25°C, la thrombine liée est libérée en utilisant une solution d’urée à 8M et une température de capillaire de 50°C. Les résultats obtenus ont montré que la phase stationnaire aptamère est capable de fixer environ 3 fois plus de thrombine que les colonnes contrôles utilisées (colonne vide ou colonne remplie de

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l’oligonucléotide dont la séquence est au hasard). Cette étude a montré que des rétentions non spécifiques de la thrombine surviennent, liées à l’adsorption de protéines au niveau de la surface du capillaire dépourvue d’aptamère. Probablement à cause de la faible surface de recouvrement de l’aptamère au niveau du capillaire ou d’une fixation inefficace de la phase stationnaire, environ 0,08 molécules de thrombine par nm² ont été capturées par ce système pour une densité de phase stationnaire de 2 aptamères attachés par nm². L’étude a également été réalisée en présence de Sérum Albumine Bovine (SAB) seule ou en mélange avec la thrombine. Il a été démontré que la SAB n’est pas retenue par les différentes colonnes utilisées et, qu’elle n’empêche pas la fixation de la thrombine lorsque le mélange SAB-thrombine est utilisé [264].

En utilisant une stratégie élégante d’élution basée sur une méthode photolytique, la détection de l’ARN polymérase et de l’ARN réplicase du virus de l’Hépatite C (VHC) a été réalisée à partir d’un mélange de protéines par chromatographie d’affinité sur puce, par utilisation de microbilles [265,266]. L’aptamère en série ARN, dirigé contre la protéine (ARN polymérase [265] ou l’ARN réplicase du VHC [266]), est couplé aux microbilles par l’intermédiaire d’un lien photoactivable. Les billes sur lesquelles l’aptamère est immobilisé sont ensuite introduites dans une puce composée de microcanaux transparents. Un échantillon de protéines est alors injecté dans la microchambre et incubé pendant 5 à 30 minutes. Après lavage, le microcanal est irradié par une lumière UV à 360 nm puis la protéine capturée est éluée par passage de la phase mobile.

Dans l’étude concernant la détection de l’ARN polymérase du VHC [265], après élution, la protéine est soumise à des traitements successifs à la trypsine, puis le mélange de peptide est concentré et appliqué à une analyse de spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. La limite de détection de ce système a été estimée à environ 10 fmol d’ARN polymérase VHC.

Dans l’étude pour l’analyse de l’ARN réplicase du VHC [266], la protéine est marquée par une fluorescéine et la cible éluée est quantifiée par une mesure de l’intensité de fluorescence en utilisant un microscope confocal. Il a été démontré que ce système est capable de détecter l’ARN réplicase du VHC à partir d’un mélange de protéines contenant 170 fmol de la protéine cible.

Mc Grown et son équipe ont étudié les capacités de séparation d’aptamères formant des structures en G-quartet pour des protéines non ciblées.

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Ainsi, en 2003, les auteurs ont utilisé, en électrochromatographie capillaire un aptamère ADN, formant une structure en G-quartet à quatre plans (figure 53b) de bonne stabilité, immobilisé de façon covalente au niveau d’un capillaire, pour séparer des protéines non ciblées qui diffèrent seulement de deux acides aminés (β-lactoglobulines A et B), [267]. En utilisant, comme expérience de contrôle, un capillaire couplé à un oligonucléotide de composition similaire possédant une séquence au hasard, n’ayant pas la capacité de former une structure en G-quartet, les auteurs n’ont observé aucune séparation en présence de ce type de séquence. Il a été démontré que les structures en G-quartet en quatre plans jouent un rôle dans la discrimination de protéines non ciblées.

Cette étude a ensuite été étendue à la séparation de plusieurs protéines bovines du lait

[268]. Deux structures : l’aptamère ADN en G-quartet à quatre plans, utilisé pour l’étude

précédente [267] et, un aptamère ADN anti-thrombine formant une structure en G-quartet à deux plans ont été testés (figure 53a et b). Les structures en deux plans, telles que l’aptamère anti-thrombine, n’ont pas la capacité de former une structure en G-quartet en absence de cations tels que K⁺. Au contraire, les structures en 4 plans ont la capacité des structures en G-quartet même en l’absence de cations et sont exceptionnellement stables. La température de fusion (Tm) liée au dépliement de la structure en G-quartet a été déterminée [267,286,287]. Elle est de 34°C pour l’aptamère spécifique de la thrombine et est supérieure à 70°C pour l’aptamère formant une structure à 4 plans en présence de 1 mM de KCl. En absence de KCl, l’aptamère à 2 plans anti-thrombine n’a pas la capacité de former une structure en G-quartet alors que l’aptamère à 4 plans montre une température de fusion de 28°C. Il a été montré que la structure en G-quartet à quatre plans permet une bonne résolution des caséines alors que les phases stationnaires formant deux plans ne permettent pas la séparation de ces protéines. Etant donné que les expériences ont été menées en absence d’ions potassium, les auteurs ont attribué ces différences de comportement à une perte des structures en G-quartet pour la structure oligonucléotidique la moins stable. Ce travail a montré que les phases stationnaires de type G-quartet ont la capacité de séparer des protéines possédant des structures très similaires.

Finalement, les deux phases stationnaires en G-quartet (2 plans et 4 plans) ont été étudiées en présence de 1 mM d’ions potassium pour séparer l’albumine de différentes espèces [269]. Il apparaît que les phases stationnaires à deux plans se comportent différemment par rapport aux structures à quatre plans pour la résolution de ces molécules. En effet, la structure à 2 plans semble offrir plus de flexibilité par rapport à la structure à 4 plans

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plus rigide, ce qui pourrait faciliter les interactions avec les protéines et donc expliquer ces différences de résolution entre les deux types de structures.

Bien que toutes ces études aient démontré les avantages à utiliser des phases stationnaires ADNs formant des G-quartets pour la séparation de protéines non ciblées ou de protéines possédant des interactions faibles avec l’aptamère, il semblerait, cependant, que cette stratégie soit d’un d’intérêt limité puisque les séparations sont basées seulement sur des interactions non spécifiques avec l’ADN immobilisé (espèces non ciblées) et sont essentiellement non prédictibles [288].

Toutes ces séparations ont été réalisées sur des colonnes remplies

[254,259,260,265,266] ou des capillaires à tube ouvert [121,256,261,262,264,267-269]. Une

limitation de ces derniers est leur faible capacité d’immobilisation à cause de la surface limitée de la paroi interne du capillaire. D’un autre côté, les colonnes remplies possèdent soit un volume mort important quand elles sont remplies avec de grosses particules soit des pressions importantes lorsqu’elles contiennent de petites particules. Les colonnes monolithes formées de polymères poreux réticulés présentent un certain nombre d’avantages, incluant une facilité de préparation, des cinétiques de transfert de masse rapide, des pressions faibles et des capacités d’immobilisation importantes.

Très récemment, Zhao et son équipe ont développé une nouvelle technique de chromatographie capillaire d’affinité combinant les avantages des aptamères et des monolithes pour séparer des protéines [270]. Un aptamère sélectionné contre le cytochrome c

[289] a été lié par un lien biotine-streptavidine à la surface d’une colonne monolithique. Une

étude par analyse frontale a montré que 164 pmoles d’aptamères ont été immobilisés par µL de colonne soit une immobilisation 14 fois plus importante que celle obtenue en électrochromatographie capillaire à tube ouvert (immobilisation 12 pmoles d’aptamères/µL)

[264]. Cette immobilisation est comparable à celle obtenue avec des colonnes remplies par

des microbilles (200 pmoles/µL) [259]. Cette phase stationnaire possède la capacité de retenir spécifiquement le cytochrome c. En revanche, d’autres protéines (HSA, IgG, transferrine, Hb) sont éluées dans le volume mort. Etant donné que l’aptamère immobilisé possède une structure en G-quartet, les auteurs ont étudié la capacité de celui-ci à séparer la thrombine, une protéine reconnue également par un aptamère en G-quartet. Il s’est avéré que la thrombine possède une affinité importante pour l’aptamère immobilisé qui est même supérieure à celle de la molécule cible. Les auteurs ont donc réalisé la séparation de trois protéines : la transférine, éluée dans le volume mort, le cytochrome c et la thrombine éluée en présence

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d’une solution concentrée en NaCl. Cette méthode a permis la détection du cytochrome c et de la thrombine dans des échantillons de sérum sans interférences avec d’autres protéines.