aptamères, des molécules aux propriétés
I.4.3 Les améliorations du temps nécessaire à la sélection
I.4.3.3 Electrophorèse capillaire en équilibre de mélanges en équilibre (ECEEM) et Electrophorèse capillaire en non-équilibre de mélanges en équilibre (NECEEM) Electrophorèse capillaire en non-équilibre de mélanges en équilibre (NECEEM)
Il faut noter que très peu de sélections d’aptamères ont été réalisées par CE-SELEX car les méthodes d’électrophorèse capillaire conventionnelles telles que l’électrophorèse capillaire de zone et l’électrophorèse capillaire d’affinité ne sont pas des méthodes fournissant des paramètres cinétiques. Ainsi, la CE-SELEX ne répond pas aux 3 conditions nécessaires aux techniques de sélection des aptamères incluant : (1) une bonne efficacité de séparation entre les séquences affines et les séquences non liées, (2) la capacité à déterminer les paramètres d’interaction aptamère-molécule cible (Kd, kon et koff) et, (3) la capacité à sélectionner des aptamères dont les paramètres de fixation sont prédéterminés. Deux techniques : l’électrophorèse capillaire en équilibre de mélanges en équilibre (ECEEM) et l’électrophorèse capillaire en non-équilibre de mélanges en équilibre (NECEEM), développées par Krylov et ces collaborateurs, satisfont ces 3 conditions.
Le principe de la sélection des aptamères basé sur la NECEEM est illustré à la figure
8.
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Dans la première étape, la bibliothèque d’ADNs (en vert) et la molécule cible T (en bleu) sont incubées ensemble afin de former un mélange en équilibre EM (en noir). Ainsi, les molécules d’ADNs ayant une forte affinité pour la molécule cible seront principalement liées, alors que les molécules ayant une faible affinité seront non liées. Donc, le mélange EM est constitué d’ADNs libres (en vert), de complexes ADN-molécule cible (ADN-T en rouge) et de molécules cibles non liées (en bleu) (figure 8a). Il faut noter que les auteurs utilisent une détection par fluorescence induite par laser (LIF) et que seul l’ADN et les complexes ADN-T sont détectables car seul l’ADN est marqué.
Dans une deuxième étape, le mélange EM est injecté dans le capillaire et un courant important est appliqué pour permettre la séparation de 2 fractions en équilibre : ADN-T et ADN libre par électrophorèse capillaire dans des conditions de non-équilibre (figure 8b). La principale différence entre ECEEM et NECEEM réside dans le fait que dans la première méthode, l’analyse se fait dans des conditions en équilibre c’est-à-dire que le tampon de migration contient la molécule cible à une concentration identique à celle présente dans le mélange en équilibre, alors que dans la deuxième méthode, le tampon de séparation ne contient ni ADN, ni molécule cible, l’analyse se fait donc dans des conditions de non-équilibre.
Dans l’exemple exposé, les conditions de la NECEEM sont telles que la mobilité de T est supérieure à celle de l’ADN. Ainsi la mobilité du complexe ADN-T est intermédiaire entre celles de l’ADN et de T. Donc, lorsque le champ électrique est appliqué, les zones contenant l’ADN, le complexe ADN-T et la molécule cible non liée sont séparées. Par la suite, dans le cas de la NECEEM, l’équilibre entre ADN libre et ADN complexé n’est pas maintenu, et les complexes commencent à se dissocier et ainsi libèrent ADN et T. Il peut être noté qu’étant donnée la rapidité de séparation en NECEEM, la fixation de l’ADN ou de T libérés est négligeable. Ainsi, l’ordre dans lequel les différents composants sont récoltés en sortie du capillaire est décrit à la figure 8b : tout d’abord la fraction T en équilibre, puis la fraction T dissociée du complexe pendant la NECEEM, ensuite les complexes ADN-T, puis l’ADN dissocié du complexe pendant la NECEEM et enfin, l’ADN libre en équilibre.
Selon le but de l’analyse, différentes fractions peuvent être récupérées (figure 8c). La sélection positive correspond à la collection de la fraction ADN-T liés en équilibre (en rouge) qui contient principalement les séquences d’ADNs ayant une forte affinité pour la molécule cible (Kd < [T]). La sélection négative correspond à la récupération de la fraction contenant les ADNs libres en équilibre (en vert) qui contient principalement les séquences d’ADNs ayant une faible affinité pour la molécule cible (Kd > [T]).
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La NECEEM permet la sélection d’aptamères ADNs avec des paramètres cinétiques de fixation prédéterminés (Kd, kon et koff) :
où kon et koff sont respectivement les vitesses de formation et de dissociation du complexe. Ces deux paramètres définissent la constante de dissociation à l’équilibre : Kd= koff
/ kon. Une caractéristique de la NECEEM est que les temps de migration délimitant la sélection positive définissent la valeur de koff de l’ADN sélectionné :
où t ADN-T et t ADN sont les temps de migration en NECEEM du complexe ADN-molécule cible et de l’ADN libre, respectivement.
La valeur de la constante de dissociation à l’équilibre peut être calculée grâce à la formule précédemment décrite par les auteurs [67] où [P]0 et [ADN]0 sont respectivement les concentrations totales en molécules cibles et ADNs introduites dans le mélange en équilibre
(figure 9) et, A1, A2, et A3 sont respectivement les aires des pics 1, 2, et de la partie exponentielle 3. Les surfaces A1, et A2 + A3 sont déterminées comme décrit par la figure 9.
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A partir des valeurs de Kd et de koff, la valeur de kon peut être déterminée grâce à la formule citée précédemment : kon = koff / Kd.
Cette technique présente de nombreux avantages : une grande efficacité de sélection, seulement quelques cycles sont nécessaires à l’obtention d’aptamères. De plus, elle permet également la détermination des paramètres cinétiques de fixation et d’obtenir des aptamères dont les paramètres Kd, kon et koff sont prédéterminés. Cette caractérisation cinétique des aptamères sélectionnés avant la synthèse est un atout car elle évite de séquencer les aptamères les moins intéressants et elle limite également le coût de synthèse.
De cette façon, les auteurs ont sélectionné un aptamère contre la protéine farnésyltransférase avec une constante d’affinité du nanomolaire en seulement un cycle de sélection [66].
Drabovich et ses collaborateurs ont sélectionné un aptamère en série ADN fixant la protéine MutS [63,68] avec un Kd de 15 nM en 3 cycles de sélection en utilisant la méthode de sélection ECEEM. Cette technique permet également la sélection d’aptamères avec des paramètres cinétiques et thermodynamiques prédéterminés (=« aptamères smart ») car comme pour la NECEEM, le temps de migration des complexes dans le capillaire dépend de la valeur de Kd.
Très récemment, une nouvelle technique de sélection d’aptamères a été développée par Krylov et ses collaborateurs [69,70]. Cette stratégie nommée « non-SELEX » implique des cycles répétés de purification des complexes oligonucléotide-molécule cible sans étapes d’amplification. La figure 10 montre une comparaison entre la technique SELEX et la non-SELEX.
Figure 10 : Schéma représentatif de la sélection d’aptamères par les méthodes SELEX et non-SELEX [69].
Les auteurs ont utilisé la NECEEM pour purifier les séquences affines. Toutes les étapes nécessaires à la sélection ont pris 1 heure et peuvent être facilement automatisées. Dans leur étude, ils ont utilisé la protéine h-Ras comme molécule cible pour isoler les ADNs affins à partir d’une bibliothèque d’ADNs contenant 39 séquences aléatoires marquées en 5’ par une
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fluorescéine carboxylée en position 6. L’affinité pour la molécule cible a été nettement améliorée (de 104 µM à 0,3 µM) en seulement 3 cycles de sélection.
Les principaux avantages de cette technique sont sa rapidité et sa simplicité. En effet, la sélection est effectuée en seulement 1 heure au lieu de plusieurs jours à plusieurs semaines et peut être réalisée de façon automatisée en utilisant une simple électrophorèse capillaire commerciale. Un troisième avantage de cette méthode est sa capacité à déterminer avec précision la quantité d’aptamères présente dans chaque bibliothèque obtenue. La non-SELEX est un outil puissant pour étudier les propriétés des bibliothèques d’ADNs. Enfin un autre de ces avantages est sa capacité à sélectionner des banques non amplifiables. Cette caractéristique fait de cette technique un outil potentiellement indispensable pour la découverte de médicaments.
I.5 Comparaison des différentes procédures de SELEX
Un énorme avantage de la procédure SELEX est la possibilité d’adapter les conditions opératoires à plusieurs applications durant le processus de sélection. Un grand nombre de variations de la procédure originairement établie par Tuerk et Gold en 1990 a été décrit durant ces dernières années dans le but d’améliorer l’affinité et la spécificité des aptamères sélectionnés ou d’optimiser la méthode. Le tableau 2 résume les techniques les plus importantes évoquées précédemment.
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Tableau 2: Description de quelques exemples de méthodes de sélection d’aptamères.
Techniques Avantages Inconvénients Molécules
cibles Kd Procédure conventionnelle (purification par affinité) • Facile, • Peu coûteuse • Limitée par la capacité de résolution • Présence d'interactions non spécifiques • Protéines • Peptides • Petites molécules • Cellules du pM au nM SELEX