Les biocapteurs colorimétriques

Dans ce type de biocapteurs, l’interaction entre l’aptamère et sa cible se traduit par l’apparition d’une couleur dans le milieu réactionnel.

Un nombre important d’« aptasensors » colorimétriques ont été développés dans la littérature, la plupart d’entre eux utilisent des nanoparticules d’or (AuNPs) comme éléments de capture [175]. Les propriétés colorimétriques des nanoparticules d’or, décrites par Rothberg et ses collaborateurs [216], permettent de distinguer, à l’œil nu, un ADN déplié d’un ADN replié. En effet, en solution, les nanoparticules sont stabilisées par l’adsorption d’ions négatifs (par exemple les ions citrates) créant une répulsion entre les différentes particules d’or ce qui permet d’éviter leur agrégation par attraction de type Van der Waals. En présence d’un ADN double brin ou d’un ADN replié (lors de la fixation de la cible par exemple), la

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répulsion entre les groupements phosphates chargés négativement de l’ADN et les ions citrates adsorbés dominent l’interaction électrostatique entre l’or et l’ADN double brin empêchant ainsi l’adsorption de cet ADN sur les nanoparticules d’or. Dans ces conditions, en présence de sels les nanoparticules s’aggrègent ce qui conduit à une coloration bleu-pourpre. En revanche, l’ADN simple brin déplié est suffisamment flexible pour partiellement dérouler ses bases nucléiques. Il peut donc être ainsi exposé aux nanoparticules d’or. La charge négative du squelette phosphaté de l’ADN est suffisamment lointaine pour permettre une attraction de type Van der Waals entre les bases et les nanoparticules d’or. Ceci permet la fixation de l’ADN sur les particules d’or, évitant ainsi l’agrégation des particules. Dans ce cas, la solution se colore en rouge. Il est donc possible par cette approche de visualiser à l’oeil nu le changement de conformation de l’aptamère lié à la reconnaissance de sa molécule cible qui se traduit par le passage d’une solution colorée en rouge (aptamère déplié) à une solution colorée en bleu-pourpre (aptamère replié). Cette stratégie a été appliquée avec succès pour la détection d’ions potassium [217] et de protéines (la thrombine) [218] (figure 45).

Figure 45 : Représentation schématique d’une stratégie permettant la détection colorimétrique de la thrombine [218].

Des aptamères ont également été employés pour assembler des nanoparticules et former un biocapteur colorimétrique. Une étude a été réalisée par Liu et son équipe où l’aptamère est utilisé comme « linker » pour assembler des nanoparticules d’or fonctionnalisées par des ADNs simples brins [219,220]. En présence de la molécule cible, le changement de conformation de l’aptamère déstabilise une partie de l’ADN liée à une nanoparticule ce qui aboutit à la libération de la nanoparticule fixée alors à un ADN simple brin. Ainsi, les nanoparticules agrégées colorées en bleu-pourpre avant fixation de la cible sont séparées en des nanoparticules colorées en rouge après fixation de la cible (figure 46).

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Cet essai peut être appliqué pour l’analyse d’une grande variété de molécules par simple remplacement de la séquence de l’aptamère. Il a également été utilisé pour la détection de l’adénosine et de la cocaïne dans le sérum humain par un test rapide sur bandelette (« dipstick » test) où la nanoparticule biotinylée est liée de façon spécifique au niveau de la bandelette sur laquelle est immobilisée de la streptavidine [221].

Figure 46: Représentation schématique du biocapteur construit par Liu et son équipe permettant la détection

colorimétrique de la cible sur des bandelettes [221].

Une autre approche a été réalisée par hybridation d’un aptamère au niveau d’un ADN simple brin complémentaire fixé à des nanoparticules d’or dispersées en solution et colorées en rouge [222]. Lors de la fixation de la cible, l’aptamère acquière sa conformation active et se dissocie des nanoparticules d’or. Ces dernières alors instables s’agrègent immédiatement en présence de sels ce qui conduit à une coloration bleu-pourpre (figure 47).

Figure 47: (a) Principe de fonctionnement du biocapteur construit par Zhao et ses collaborateurs. (b) Séquences des

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Des nanoparticules d’or fonctionnalisées par un aptamère ont également été envisagées pour la détection amplifiée de protéines en utilisant une configuration en « sandwich ». Un aptamère anti-thrombine a été lié de façon covalente au niveau d’une monocouche de siloxane fonctionnalisée par un groupement maléimide puis, la thrombine a été fixée sur cette interface [223]. Ensuite, le même aptamère fonctionnalisé par des nanoparticules d’or est associé au niveau du deuxième site de fixation de la thrombine. Cette interface « en sandwich » est alors incubée dans une solution de croissance contenant HAuCl3 et des agents réducteurs (figure 48a). L’accroissement des nanoparticules d’or permet une amélioration de la sensibilité de la détection colorimétrique ce qui correspond à une concentration en thrombine de 2 nM.

Plus récemment, Li et ses collaborateurs ont développé une approche similaire faisant intervenir une amplification du signal en présence d’argent (figure 48b) [224]. Afin de faciliter la visualisation des nanoparticules d’or, les auteurs ont utilisé une procédure d’amplification du signal par réduction des ions argentés en présence d’hydroquinone en argent métallique à la surface des nanoparticules d’or ; cette étape permet la visualisation des nanoparticules avec une limite de détection de 83 aM.

Figure 48: Représentation schématique d’ «aptasensors » colorimétriques [175] construits par une configuration en

« sandwich » et amplifiés en présence d’or [223] et d’argent [224].

Plusieurs études ont également été réalisées pour le développement d’« aptasensors » sans marquage de l’aptamère. En effet, il peut être souvent difficile de choisir la position adéquate pour le marquage d’un aptamère puisqu’il persiste parfois des incertitudes concernant les sites de fixation de la cible et sur la modification éventuelle de conformation de l’aptamère. De plus, le marquage d’aptamères en série ARN, qui correspondent à une partie majoritaire des aptamères sélectionnés, est très souvent difficile à cause de l’instabilité de l’ARN [78].

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Stojanovic et ses collaborateurs ont utilisé un aptamère anti-cocaïne afin de développer un biocapteur colorimétrique spécifique de cette molécule [225]. Après incubation de l’aptamère en présence d’un colorant, l’addition de la cocaïne engendre un déplacement du colorant se traduisant par une atténuation de l’absorbance proportionnelle à la concentration de cocaïne ajoutée. Aucune variation du spectre d’absorbance n’est observée en présence de métabolites de la cocaïne. Ceci indique une sélectivité importante de ce biocapteur. De plus, celui-ci s’est avéré plus sensible et plus sélectif que les biocapteurs fluorescents construits avec le même aptamère [211,214], indiquant que l’attachement covalent d’un colorant est plus intrusif que l’attachement non covalent, engendrant probablement des modifications de la structure de l’aptamère.

Jiang et ses collaborateurs [226] ont développé une méthode de détection en utilisant les propriétés de luminescence d’un complexe au rhuténium [Ru(phen)2(dppz)]²⁺ (phen = 1,10-phenanthroline, dppz = dipyrido[3,2-a : 2’,3’-c]phenazine). Ce complexe montre une forte luminescence lorsqu’il est intercalé entre des acides nucléiques appariés mais il perd cette propriété lorsqu’il est en solution aqueuse à cause de la solvatation des atomes d’azotes du phénazine qui empêche le transfert de charge entre le métal et le ligand. Le complexe métallique peut s’intercaler au sein de l’ADN libre, il est de cette façon protégé des molécules d’eau, ce qui aboutit à une émission intense de luminescence. En revanche, lors de la fixation de la cible, l’émission de luminescence décroît (« signal off ») à cause de la perte de complexes intercalés du fait du changement de conformation de l’aptamère et du blocage de ses sites par la cible fixée. Cette méthode, très simple, n’impliquant aucun marquage, a été appliquée pour la détection de protéines importantes dans le domaine biomédical : l’IgE, le PDGF-BB et la thrombine en utilisant des aptamères ADNs et ARNs.

Finalement, Ho et son équipe ont développé un « aptasensor » optique basé sur l’utilisation d’un aptamère ADN simple brin fixant spécifiquement les ions potassium ou l’α-thrombine humaine [227]. Pour construire ce biocapteur, les auteurs ont utilisé un dérivé polythiophène cationique (poly(3-alkoxy-4-methyl-thiophene) soluble dans l’eau permettant la transduction spécifique de la fixation de l’aptamère à sa cible à travers un signal optique (colorimétrique ou fluorescent). Cet essai simple, rapide, sensible et sélectif, ne nécessitant aucune modification chimique de l’aptamère ou de la cible, est basé sur une modification de conformation du squelette du dérivé polythiophène cationique lors de sa complexation avec un ADN simple brin anionique. Le polymère cationique a des propriétés optiques différentes lorsqu’il est complexé avec un ADN simple brin et un ADN double brin (figure 49). Cette

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méthode permet la détection spécifique de la thrombine à une concentration du fM en quelques minutes et peut être adaptée à d’autres molécules.

Figure 49: Description schématique de la détection spécifique de l’α-thrombine humaine par utilisation d’un

aptamère ADN spécifique de la thrombine et d’un polymère cationique [227].