L’automatisation de la sélection

Comme précédemment cité, la technique SELEX conventionnelle est une méthode de sélection longue, répétitive, et non applicable à des sélections à haut débit. Pour surmonter cette limitation, ces dernières années, de nombreuses tentatives pour automatiser la sélection

in vitro ont été réalisées.

Ellington et ses collaborateurs ont reconnu cette limitation et ont donc automatisé le processus de sélection pour éliminer tout intervention humaine durant les trois étapes de la SELEX, à savoir la sélection, la purification et l’amplification [18,51-53]. Le premier protocole automatisé de la SELEX, constitué d’un robot Beckmann Biomek 2000, a été publié en 1998 [52]. Ce robot a été utilisé avec succès pour améliorer la sélection de molécules d’ARNs fixant un oligonucléotide riche en désoxythymidine (dT). Cet appareil est constitué d’un module thermostaté effectuant la PCR, d’un séparateur par billes magnétiques, d’un plateau contenant les échantillons, et d’un module permettant de les pipeter. Cette automatisation permet la réalisation de 9 cycles de sélection en seulement un jour au lieu de plusieurs semaines avec la SELEX conventionnelle.

Cette sélection automatisée a été améliorée par la suite en substituant la séparation par billes magnétiques par une technique de filtration sur filtres, plus efficace. Ce nouveau protocole a été appliqué pour sélectionner des aptamères en série ADN contre le lysozyme du blanc d’œuf des poules. L’aptamère ainsi obtenu possède une constante d’affinité Kd = 31 nM pour la molécule ciblée et permet une inhibition de la lyse cellulaire [18]. Les auteurs ont déclaré que cette plateforme automatisée a la capacité de réaliser 8 sélections en parallèle, exécutant 12 cycles en 2 jours.

De la même façon, la SELEX automatisée a été développée avec succès pour la sélection d’aptamères contre des protéines telles que la CYT-18 (une ARN synthétase transférant la tyrosine au niveau de la mitochondrie de Neurospora crassa), MEK-1 (une MAP kinase humaine) et Rho (une protéine de terminaison de la transcription chez

Thermotoga maritima) avec des constantes de dissociation variant du nanomolaire au

picomolaire [53]. Pour améliorer davantage la méthode, ils ont développé une procédure automatisée avec un système de transcription et de traduction de protéines in vitro dans le robot et, pour permettre une immobilisation spécifique, ils ont également utilisé une biotinylation in vitro [51]. Pour montrer l’applicabilité de cette méthode, les auteurs ont

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sélectionné des aptamères contre la ribonucléoprotéine humaine U1A, une des composantes du spliceosome présente dans le noyau des cellules eucaryotes. Les séquences sélectionnées miment les séquences et les motifs de fixation naturels.

En 2005, Eulberg et ses collaborateurs [54] ont développé un système d’automatisation de la SELEX permettant une grande flexibilité et adaptabilité en terme du choix de tampon et des conditions de sélection. Le robot utilisé est un RoboAmp 4200 E (MWG Biotech, Allemagne) ayant la capacité de réaliser 2 cycles de sélection par jour ce qui est donc moins rapide que le système développé par Cox et Ellington [18]. Ce système est cependant beaucoup plus flexible et les échantillons sont traités de la même façon que manuellement, ce qui permet d’augmenter les chances de succès de la sélection. Ils ont ainsi sélectionné un aptamère en série ARN spécifique de l’image dans un miroir de la substance P (D-peptide). Dans le but d’obtenir un oligonucléotide antagoniste de la substance P ayant un potentiel thérapeutique, donc résistant aux nucléases, les auteurs ont utilisé le spiegelmer de l’aptamère sélectionné c’est-à-dire l’ARN en série L. Cet aptamère ainsi sélectionné fixe et inhibe la substance P en série L naturelle avec un Kd de 40 nM et une IC50 de 45 nM.

Très récemment, en 2006, Hybarger et ses collaborateurs [55] ont introduit un prototype automatisé de la SELEX microfluidique. Celui-ci repose sur de simples gradients de pression pour charger et permettre le transport des réactifs à travers des microcanaux. Il est composé d’un dispositif d’injection par pression, de microtubes permettant le stockage des réactifs, d’une machine PCR thermostatée, et de valves permettant le cheminement des échantillons. Les modules correspondant à chaque étape de la sélection peuvent être facilement enlevés ou modifiés. Bien que l’injection des échantillons se fasse de façon manuelle, les étapes suivantes sont automatisées. Ce prototype de SELEX microfluidique est capable de réaliser la transcription, la sélection, la transcription inverse et l’amplification par PCR de façon automatisée. Un aptamère en série ARN contre le lysozyme a été sélectionné manuellement et en utilisant cette machine. Ces deux méthodes ont permis l’obtention d’aptamères identiques, ce qui a permis de valider ce prototype. Ce dernier permet la sélection mais également la synthèse de l’aptamère anti-lysozyme ce qui a été vérifié par une analyse de la séquence. Il s’agit d’un nouvel outil de miniaturisation de la SELEX qui permet une réduction de sa durée, de son coût et qui prend moins de place.

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I.4.3.2 La CE-SELEX

Mendonsa et Bowser ont montré que l’électrophorèse capillaire (CE) peut être utilisée pour améliorer les sélections d’aptamères (CE-SELEX) [16,17]. En effet, l’électrophorèse capillaire présente de nombreux avantages, par rapport aux autres techniques précédemment évoquées utilisées pour la SELEX, telles qu’une rapidité d’analyse, une bonne capacité de résolution et une faible quantité de produit nécessaire à l’analyse. Des aptamères possédant de faibles constantes de dissociation peuvent être isolés en seulement deux cycles de sélection ce qui est largement plus rapide que la SELEX conventionnelle qui peut prendre plusieurs semaines. D’autre part, avec la SELEX conventionnelle, les interactions non spécifiques avec les supports (filtres ou supports chromatographiques) sont souvent problématiques. Avec la CE-SELEX, la sélection a lieu en solution ce qui élimine les inconvénients de la méthode, évoqués précédemment, liés à la présence du support chromatographique ainsi qu’à la présence d’un bras espaceur. Les sélections négatives couramment utilisées dans la méthode conventionnelle n’ont pas lieu d’être pour la CE-SELEX ce qui simplifie considérablement la méthode. Un autre avantage moins évident de la CE-SELEX est le nombre de séquences d’aptamères obtenu. Après 8 - 12 cycles de sélection conventionnelle, souvent des motifs de séquence prédominent (séquence concensus). Ces motifs ne sont pas observés en CE-SELEX, ce qui indique que l’hétérogénéité du pool reste élevée même après sélection [16,17,56,57]. Ceci suggère que la CE-SELEX fournit un nombre plus important de séquences indépendantes possédant une forte affinité par rapport à la sélection par la méthode conventionnelle.

Bowser et ses collaborateurs ont sélectionné un aptamère spécifique de l’immunoglobuline E (IgE) par CE-SELEX [16,17] (figure 7). Cette méthode implique une séparation des espèces liées basée sur les différences de mobilité dûes à la formation du complexe aptamère-molécule cible. Pour cette sélection, les auteurs ont utilisé un capillaire recouvert de poly(vinyl)alcool de 40,2 cm de longueur et avec un diamètre interne de 50 µm. Le mélange contenant les oligonucléotides aléatoires et l’IgE sont introduits dans le capillaire par une pression de 5 psi (Pound per Square Inch) pendant 5 secondes et sont détectés à 254 nm. Sous l’application du champ électrique, en mode anodique (-20 kV), les ADNs non spécifiques seront récoltés en premier et, les ADNs liés à l’IgE migreront beaucoup moins rapidement. Ces ADNs liés sont ensuite amplifiés par PCR puis utilisés en simple brin pour un nouveau cycle.

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Figure 7 : Schéma décrivant le principe de la CE-SELEX appliqué à l’étude de Mendonsa et Bowser [16].

Par cette méthode, différents clones ont été obtenus après le deuxième et le quatrième cycle de sélection avec des constantes de dissociation de 27 à 84 nM, légèrement supérieures à celles obtenues avec la SELEX conventionnelle. En effet, un aptamère spécifique de l’IgE a également été sélectionné par la SELEX conventionnelle et présente un Kd de 6 nM en 15 cycles de sélection [58]. De plus, après seulement 2 cycles de sélection de CE-SELEX, environ 100% des séquences sélectionnées dans la bibliothèque d’ADNs fixent l’IgE. Ce taux d’enrichissement est important si on le compare avec un taux obtenu par la SELEX (50, 93 et 100% après 6, 12 et 18 cycles, respectivement) [51].

Les Kd typiquement obtenues par CE-SELEX sont de l’ordre du nanomolaire voire du picomolaire. En effet, un aptamère spécifique de la transcriptase inverse du VIH-1 possédant un Kd de 180 pM, a été sélectionné par cette méthode [56]. Ces aptamères ainsi sélectionnés possèdent également une haute sélectivité pour leurs molécules cibles.

Le tableau 1 permet une comparaison du nombre de cycles de sélection ainsi que des constantes de dissociation obtenues pour différentes molécules cibles par CE-SELEX et par SELEX conventionnelle [59]. Nous pouvons observer que le nombre de cycles de sélection est toujours inférieur en CE-SELEX et, selon les molécules cibles, l’affinité des aptamères sélectionnés est parfois meilleure en CE-SELEX par rapport à celle obtenue par la SELEX conventionnelle (cas de la transcriptase inverse du VIH par exemple).

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Tableau 1: Comparaison des aptamères sélectionnés par CE-SELEX et par la SELEX conventionnelle.

CE-SELEX SELEX Molécules cibles Kd (nM) Cycles Kd (nM) Cycles IgE 23 ± 12 [16] 4 6 [58] 15 RT-HIV 0,18 ± 0.07 [56] 4 1 [60] 12 Neuropeptide Y 300 ± 200 [57] 4 370 [61] 12 PFTase 0.5 [62] 1 nd - MutS 3,6 ± 0.5 [63] 3 nd - Kinase C-δ 122 [64] 9 nd - Ricine 58 ± 19 [65] 4 105 ± 41 [65] 9

Une limitation de cette technique est la nécessité d’avoir une différence de mobilité électrophorétique suffisamment importante entre les acides nucléiques liant les molécules cibles et les oligonucléotides non affins. Lorsque la cible présente un poids moléculaire important (IgE ~ 200 kDa, RT-HIV-1 ~ 120 kDa, la protéine farnésyltransférase (FTase) ~ 45 - 48 kDa [62]), le complexe ADN (~ 25 kDa) - molécule cible est suffisamment retardé pour permettre la séparation. A noter cependant que la CE-SELEX a pu être appliquée à de petites molécules. Mendonsa et Bowser ont réussi à sélectionner un aptamère spécifique du neuropeptide Y, un peptide de 36 acides aminés (4,2 kDa) [57]. Pour améliorer la résolution entre les complexes aptamère-protéine et les acides nucléiques non liés, les auteurs ont utilisé des concentrations en ADN simple brin plus faibles que celles utilisées habituellement.

La CE-SELEX possède un autre inconvénient qui repose sur le volume injecté (de l’ordre du nanolitre). Seulement une quantité limitée de brins d’oligonucléotides ADNs peut être injectée sans surcharger la colonne, ce qui limite le nombre de séquences d’ADNs utilisées pour la sélection (10¹³ vs 10¹⁵ séquences utilisées en SELEX conventionnelle). Pour surmonter cette limitation et permettre l’utilisation d’un nombre de séquences dans la bibliothèque plus important, les solutions proposées sont une augmentation de la concentration des bibliothèques d’ADNs simples brins, une augmentation du diamètre interne du capillaire utilisé pour la séparation ou une augmentation du nombre de cycles réalisés par électrophorèse capillaire [57].

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I.4.3.3 Electrophorèse capillaire en équilibre de mélanges en équilibre (ECEEM) et