Pour reconstituer in vitro les m´ecanismes du transport intracellulaire le long de MTs, les constituants de base sont :
– des organites purifi´es
– des MTs, qui, comme nous l’avons vu au paragraphe A.4.2, sont essentiels puisqu’ils servent de rails au transport. Ces MTs sont stabilis´es, c’est-`a-dire qu’ils gardent une longueur constante dans le temps.
– des extraits de cellules contenant toutes les prot´eines n´ecessaires au transport, y compris les moteurs mol´eculaires et les prot´eines n´ecessaires `a leur attache-ment `a la membrane
– de l’ATP.
Plusieurs ´equipes ont de cette fa¸con reconstitu´e des r´eseaux de tubes de membrane le long de MTs avec quelques variations (fig. 1.19). Tout d’abord, Dabora et Sheetz ont utilis´e du cytosol et des microsomes bruts de fibroblastes de poussin [Dabora and Sheetz, 1988]. Parall`element, Vale et Hotani ont utilis´e des kin´esines de calamars partiellement purifi´ees dans un tampon qui contenait ´egalement des membranes dont la constitution n’´etait pas d´etermin´ee [Vale and Hotani, 1988]. Plus tard, Allan et Vale ont montr´e que l’utilisation de cytosol d’ovocytes de
Chapitre 1. De la cellule vivante aux syst`emes biomim´etiques
Xenopus permettait d’observer la formation de r´eseaux de tubes de membrane `a partir de microsomes d’ovocytes bruts, ou bien de membranes de RE ou Golgi purifi´ees `a partir de foies de rats [Allan and Vale, 1991, Allan and Vale, 1994, Allan, 1995, Niclas et al., 1996, Fullerton et al., 1998].
Fig. 1.19 – R´eseaux de tubes de RE tir´es in vitro le long d’un r´eseau de MTs stabilis´es. Les MTs sont `a gauche, marqu´es en rouge et le RE (membrane purifi´ee `a partir de foies de rats) est marqu´e en vert. Cette photo est `a mettre en parall`ele avec celle montrant un r´eseau de RE in vivo figure 1.8. Images issues du site internet du groupe de Vicki Allan.
X Avantages de l’utilisation d’extraits cellulaires
• Le premier avantage vient du fait que l’on peut bloquer une par une les prot´eines d’int´erˆet et voir l’influence de chaque prot´eine sur le r´eseau de tubes (par exemple la prot´eine phosphatase 1 [Allan, 1995], ou la kin´esine bloqu´ee par un anticorps [Lane and Allan, 1999, Robertson and Allan, 2000]).
• Le deuxi`eme avantage vient du fait que les exp´eriences faites avec des extraits sont plus proches des exp´eriences in vivo compar´ees `a celles effectu´ees dans un simple tampon. Il est ainsi possible de voir l’influence de la position dans le cycle cellulaire de l’extrait utilis´e [Allan and Vale, 1991].
• Il est aussi possible d’utiliser les mˆemes techniques qu’in vivo (immunofluorescence et microscopie ´electronique) pour d´eterminer la localisation des prot´eines d’int´erˆet [Fullerton et al., 1998, Lane and Allan, 1999].
• Diverses drogues peuvent enfin ˆetre utilis´ees pour d´eterminer leur influence sur le r´eseau de tubes de membrane (voir tableau 1.1), ce qui permet de mieux comprendre quels sont les ´el´ements impliqu´es dans le trafic de membrane.
X Application `a l’´etude des transports RE-Golgi et Golgi-RE
Ce genre d’´etude a permis de montrer que le mouvement du RE est largement inhib´e lorsqu’un extrait de cellules en m´etaphase est utilis´e, ce qui est dˆu au d´etachement
B. Reconstitution in vitro des tubes de membrane
Drogue ou r´eactif Pr´esence Commentaires
de tubes
2 mM ATP ++ Contrˆole
AMP-PNP - Hydrolyse de l’ATP n´ecessaire
Apyrase - Pr´esence d’ATP dans les extraits n´ecessaires
20 µM Colcichine - Importance des MTs
20 µM Vanadate + Inhibition partielle de la kin´esine 100 µM Vanadate - Inhibition totale de la kin´esine 2 µM Cytochalasine ++ Pas de rˆole du cortex acto-myosine
GTP γS - Motilit´e r´egul´ee par des petites GTPases N-Ethhylmaleimide - N´ecessit´e de la fusion de
(NEM) membrane pour avoir des r´eseaux
EGTA ++ Pas de rˆole du Ca2+ dans la motilit´e Tab. 1.1 – Action de diff´erentes drogues ou r´eactifs sur la formation du r´eseau de tubes de RE ou de Golgi in vitro. Donn´ees tir´ees de [Dabora and Sheetz, 1988, Allan and Vale, 1991]. L’apyrase permet d’enlever l’ATP pr´esent dans les extraits. Sauf dans ce premier encadr´e qui sert `a montrer le rˆole d’ATP dans la formation des tubes, il est sous-entendu que 2 mM d’ATP sont ajout´es dans chaque exp´erience. Le vanadate inhibe les moteurs mol´eculaires. Cependant, comme la kin´esine est peu sensible au vanadate, il faut en ajouter une grande quantit´e pour bloquer la formation de tube. La cytochalasine permet de d´epolym´eriser en partie le cortex d’actine. Le N-Ethhylmaleimide (NEM) et le GTPγS sont des inhibiteurs de fusion de membrane, sans eux les r´eseaux de tubes ne peuvent pas se former. En revanche, le mouvement de petites v´esicules reste possible dans le cas du traitement au NEM. La colchicine est une drogue qui d´etruit les MTs.
des dyn´eines (et/ou de son complexe associ´e, la dynactine). Ce d´etachement co¨ıncide avec l’hyperphosphorylation de la chaˆıne interm´ediaire de la dyn´eine cytoplasmique [Allan and Vale, 1991, Niclas et al., 1996]. Au contraire, l’utilisation d’extrait de cel-lules en interphase et d’un inhibiteur des phosphatases permet de stimuler largement le trafic de membranes de RE, sans pour autant affecter le nombre de dyn´eines accro-ch´ees `a la membrane [Allan, 1995]. Plus r´ecemment, il a ´et´e montr´e que la direction du mouvement du RE sur les MTs est r´egul´ee par les composants pr´esents dans le cytosol des cellules. En effet, le cytosol pr´epar´e `a partir de cellules de tissu active le mouvement de membranes de RE d’œufs de Xenopes, vers l’extr´emit´e ”+” des MTs (donc est contrˆol´e par des kin´esines) [Lane and Allan, 1999] alors que le cytosol issu de cellules de jeunes embryons ne l’active pas. La r´egulation du trafic par les ´el´e-ments du cytosol d´epend donc du type de cellules, comme de l’avancement de leur propre d´eveloppement.
En ce qui concerne le transport du Golgi vers le RE qui implique des kin´esines, des ´etudes in vitro de transport de membrane ont permis d’isoler des moteurs impliqu´es dans la formation de tubules en pr´esence de BFA le long de MTs. Ces moteurs doivent
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encore ˆetre mieux caract´eris´es, mais ce ne sont pas des kin´esines conventionnelles [Robertson and Allan, 2000]. L’utilisation des diff´erents types d’extraits a permis de montrer que la formation de tubules est active avec un extrait de cellules en interphase mais pas avec un extrait de cellules en m´etaphase, comme ce qui avait ´et´e montr´e dans le cas du RE. Ceci prouve qu’il existe un m´ecanisme de r´egulation des kin´esines pendant le cycle cellulaire. On peut remarquer ici que les ´etudes in vitro apportent des r´eponses compl´ementaires aux ´etudes in vivo pr´esent´ees dans la premi`ere partie de ce chapitre, sur les moteurs impliqu´es dans les trafics RE-Golgi et Golgi-RE.
Il est important de noter enfin qu’il est aussi possible de reconstituer in vitro un large r´eseau de tubes de membrane de RE, mˆeme en l’absence de r´eseau de MT mais en utilisant du cytosol [Dreier and Rapoport, 2000]. Mˆeme si les prot´eines impliqu´ees dans la formation d’un tel r´eseau interconnect´e n’ont pas ´et´e isol´ees, il est possible d’en d´eduire que le cytosol poss`ede tous les composants n´ecessaires `a la modification et la r´egulation des r´eactions de fusion de membranes pour former des tubes `a partir de v´esicules.
X Mise en ´evidence d’un domaine globulaire au niveau du bout du tube
Allan et Vale ont ´etudi´e la formation de r´eseaux de tubes de membrane de Golgi et de RE in vitro [Allan and Vale, 1994](fig. 1.20 (A)). Ils ont mis en ´evidence la pr´esence d’un domaine globulaire au bout des tubes en train d’ˆetre tir´es. Ces domaines sont plus gros dans le cas du Golgi et probablement enrichis en moteurs mol´eculaires ´etant donn´e leur interaction avec les MTs (fig. 1.20, (B-a)). Une ´etude en immunofluorescence a permis de montrer qu’ils contiennent de l’albumine et des produits de s´ecr´etion (particuli`erement dans le cas des tubes de Golgi, d’o`u la taille des domaines). La localisation des moteurs n’a pourtant pas pu ˆetre men´ee `a terme, peut-ˆetre `a cause de la trop faible sensibilit´e des ´etudes par immunofluorescence ou bien parce que le nombre de moteurs n´ecessaires pour tirer le tube n’est pas suffisamment important. Nous verrons par la suite (au chapitre 5), que les exp´eriences que nous avons r´ealis´ees sont en mesure de contourner ce genre de probl`eme, de fa¸con `a mettre en ´evidence de fa¸con quantitative la position des moteurs n´ecessaires qui tirent un tube.
X Inconv´enients de l’utilisation d’extraits cellulaires
On peut finalement reprendre les arguments utilis´es sur le probl`eme du nombre inconnu de constituants impliqu´es dans la formation des tubes in vivo. En effet, les extraits contiennent ´enorm´ement de prot´eines qui interviennent ou non, mais il est impossible de comprendre quels sont les constituants minimaux n´ecessaires pour former un tube. On a mˆeme vu dans certains cas que des tubes pouvaient ˆetre obtenus sans MT. La meilleure fa¸con de d´eterminer les constituants minimums est donc d’utiliser des ´el´ements compl`etement purifi´es ou artificiels et contrˆol´es. Il n’y aura alors plus de doute sur les constituants indispensables `a la formation et `a l’´elongation des tubes.
B. Reconstitution in vitro des tubes de membrane
Fig. 1.20 – (A) R´eseaux de tubes de Golgi tir´es in vitro le long d’un r´eseau de MTs stabilis´es (membrane purifi´ee `a partir de foies de rats) observ´es en DIC. Des images similaires ont ´et´e obtenues dans le cas de r´eseaux de RE. Barre=5 µm. (B-a,b,c) Trois images en microscopie ´electronique du domaines globulaire situ´e `a l’extr´emit´e de tubes de Golgi. On remarque la forte interaction avec le MT dans le cas de (a). La plupart du temps, les tubes sont align´es avec les MTs. Leur diam`etre peut ˆetre ´evalu´e `a une centaine de nm. Barre=200 nm. D’apr`es [Allan and Vale, 1994].