B.2 Etude cin´etique, influence de la force appliqu´ee et de la concen-
B.2.4 Influence de la force appliqu´ee sur la kin´esine : la
Pour pouvoir appliquer une force sur un moteur mol´eculaire sans le d´et´eriorer, une possibilit´e est d’utiliser une pince optique qui pi`ege une bille au point focal d’un faisceau laser focalis´e. Si la bille est en plus attach´ee `a une kin´esine en condition de mol´ecule unique (faible rapport kin´esine par bille), et avance le long d’un MT, alors la force appliqu´ee `a la bille est transmise au moteur. Quand la bille s’´eloigne du centre du pi`ege (parce qu’elle est tir´ee par un moteur par exemple), le pi`ege exerce sur elle une force de rappel ´elastique, comme un ressort. On peut alors, `a partir de la position de la bille par rapport au pi`ege, remonter `a la force appliqu´ee sur la bille (fig. 2.12 tir´ee de [Visscher et al., 1999]), et `a la variation de la vitesse en fonction
Chapitre 2. Principales caract´eristiques des constituants impliqu´es dans la formation de tubes de membrane.
de cette force.
Fig. 2.12 – (a) Sch´ema expliquant le principe d’une mesure de force appliqu´ee avec une pince optique : un moteur mol´eculaire avan¸cant le long d’un MT est attach´e `a une bille pi´eg´ee dans une pince optique. La position de la bille par rapport au pi`ege ∆x permet de remonter `a la force appliqu´ee sur le moteur. Le pi`ege suit la position de la bille grˆace `a un syst`eme de r´etroaction en force. Un exemples d’acquisitions obtenues pour la position de la bille (”bead”) et du pi`ege (”trap”) est repr´esent´e : des pas de 8 nm sont visibles et le temps entre les pas est stochastique, illustrant la stochasticit´e du moteur ´etudi´e (fr´equence d’acquisition : 20 kHz, ∆x=175 nm, 2 mM d’ATP) ; (b) ´Ecart entre les positions de la bille et du pi`ege ∆x dans l’acquisition (a) ; (c) Histogramme de la force appliqu´ee obtenu `a partir des d´eplacements repr´esent´es au (b) en tenant compte de la constante de raideur du pi`ege (0.037 pN/nm). La ligne rouge continue est un fit gaussien qui donne la force appliqu´ee sur la bille : 6,5 ±0,1 pN, d’apr`es [Visscher et al., 1999].
La mise au point d’une pince optique tr`es performante avec une r´etroaction qui permet d’appliquer une force constante, dans toutes les directions, sur une
B. Les kin´esines conventionnelles, moteurs mol´eculaires qui transportent les cargos
bille et de la suivre dans son mouvement [Lang et al., 2002], a permis de faire des mesures de vitesse tr`es pr´ecises10 et sans calcul correctif pouvant introduire des er-reurs11 (contrairement au cas o`u la pince optique est statique et sans r´etroaction [Svoboda et al., 1994]). Les mesures ont ´et´e faites `a diff´erentes forces, dans diff´e-rentes directions et `a diff´ediff´e-rentes concentrations en ATP. Une partie des r´esultats est repr´esent´ee fig. 2.13.
Fig. 2.13 – (A) Courbes donnant la vitesse de la bille en fonction de la force longi-tudinale appliqu´ee (le long du MT). Les forces n´egatives correspondent aux forces dans le sens inverse du mouvement et les forces positives sont celles dans le sens du mouvement. La courbe bleue (la plus haute) a ´et´e mesur´ee `a 1,6 mM d’ATP, donc `a saturation, et la courbe rouge a ´et´e mesur´ee `a 4.2 µM d’ATP (en condition ATP limitante). (B) Courbe donnant la constante de Michaelis-Menten en fonction de la force longitudinale appliqu´ee, d’apr`es [Block et al., 2003].
Lorsqu’une force longitudinale (dans la direction du microtubule) est appliqu´ee sur la bille dans la direction du d´eplacement des moteurs (ici F>0), on remarque sur la fig. 2.13 que la vitesse est tr`es peu affect´ee par la force. La force vers l’avant n’aide donc pas la kin´esine `a avancer plus vite, contrairement `a ce qui avait ´et´e publi´e pr´e-c´edemment [Coppin et al., 1996]. Lorsque la force longitudinale est appliqu´ee dans le sens oppos´e au mouvement, on remarque que pour les deux concentrations en ATP, la vitesse diminue en fonction de la force appliqu´ee et s’annule pour une valeur com-prise entre 5 et 8 pN. Cette valeur, g´en´eralement com-prise ´egale `a 6 pN, correspond `a la force d’arrˆet de la kin´esine (”stall force” appel´ee FS par la suite). La variation de la force d’arrˆet avec la concentration en ATP a ´et´e mesur´ee pr´ecis´ement dans [Visscher et al., 1999]. Les valeurs obtenues avec les pinces optiques sont en bon ac-cord avec les r´esultats obtenus par d’autres m´ethodes : [Meyhofer and Howard, 1995]
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L’utilisation d’une diode `a quatre quadrants a permis de beaucoup augmenter la r´esolution spatiale (subnanom´etrique) par rapport aux d´etections avec une cam´era classique, et l’utilisation de fr´equences d’acquisition ´elev´ees permet d’augmenter la r´esolution temporelle en dessous de la milliseconde.
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pour d´eterminer la position relative du moteur par rapport `a celles de la bille et de la platine du microscope
Chapitre 2. Principales caract´eristiques des constituants impliqu´es dans la formation de tubes de membrane.
ont mesur´e la force d’arrˆet en utilisant une microfibre pour exercer une force cali-br´ee sur un MT tir´e par une kin´esine (5,4 pN) ; [Hunt et al., 1994] en appliquant une force visqueuse croissante et mesurant la vitesse de microtubules tir´es par une kin´esine unique dans un ”gliding assay” (une extrapolation de la force d’arrˆet donne 4,5 pN) et [Gittes et al., 1996] en mesurant la courbure d’un microtubule fix´e d’un cˆot´e et tir´e par une kin´esine unique dans une sorte de gliding assay modifi´e (6 pN). Sachant qu’une kin´esine peut produire une force maximale de 6 pN sur une distance de 8 nm, on en d´eduit que le travail maximal qu’elle peut effectuer sur un pas est 48 pN.nm (= 12 KBT ), ce qui correspond environ `a la moiti´e de l’´energie d´elivr´ee par l’hydrolyse d’une mol´ecule d’ATP dans le milieu cellulaire (20-25 KBT ). La force d’arrˆet correspond donc `a 50% de la force thermodynamique (12,5 pN = 100 pN.nm/8nm) qui correspond `a la force maximale que l’on peut obtenir si toute l’´energie chimique est transform´ee en ´energie m´ecanique [Howard, 2001] (ce qui concr`etement n’est jamais possible) ; la kin´esine est donc bien un moteur hors ´equilibre thermodynamique.
D’autre part, le fait que la vitesse de la kin´esine d´epende de la force de freinage appliqu´ee sur elle corrobore le fait que les constantes cin´etiques d´ecrivant l’hydrolyse de l’ATP pendant le pas d´ependent aussi de la force appliqu´ee. C’est ce qui est repr´esent´e fig. 2.13(B) : la constante Km qui repr´esente principalement l’inverse de l’affinit´e de l’enzyme pour le substrat augmente beaucoup avec la force de freinage. La force appliqu´ee diminue donc beaucoup l’affinit´e de la kin´esine avec l’ATP. Ceci confirme qu’il existe bien un couplage m´ecano-chimique entre le cycle d’hydrolyse de l’ATP et le changement de conformation m´ecanique de la kin´esine qui donne lieu au pas. Le d´etail de ce couplage reste encore incompris, notamment `a quelle(s) ´etape(s) la force est g´en´er´ee12 et quel est le m´ecanisme de coop´erativit´e entre les deux tˆetes, mˆeme si quelques hypoth`eses sont en cours de validation (voir §B.1.3) [Endow, 2003, Cross, 2004].