R´esultats exp´erimentaux

X Conditions exp´erimentales

Pour ´etudier la r´epartition des moteurs mol´eculaires le long d’un tube, nous avons marqu´e en fluorescence les sites d’accrochage des kin´esines, c’est-`a-dire les lipides biotinyl´es. Nous avons utilis´e pour cela les lipides DSPE-Rhod-Biot pr´esent´es au ch.4 §A.4.3, synth´etis´es dans le groupe de Line Bourel-Bonnet `a l’Institut Pasteur de Lille [Jolimaitre et al., 2005]. Le fait d’avoir un fluorophore par moteur va nous permettre de faire une analyse quantitative d’intensit´es relatives de fluorescence et d’en d´eduire la r´epartition des moteurs le long du tube. Bien entendu, il n’est pas possible, dans ce cas, de distinguer entre la population des moteurs li´es et des

C. Etude aux temps longs de la dynamique de r´epartition des kin´esines le long d’un tube

moteurs d´etach´es du MT. On observe simplement la somme des deux densit´es de moteurs : ρb+ ρu.

Pour ´etudier la dynamique des moteurs qui tirent le tube, nous avons utilis´e des v´esicules :

– avec une tension de membrane σ = 2.10−4 N/m

– constitu´ees essentiellement d’EPC, donc avec une rigidit´e de courbure κ=10 KBT

– contenant 0,1% de DSPE-Rhod-Biot, ce qui correspond `a 10 fois la densit´e surfacique en moteurs minimale pour tirer un tube.

Lors d’un ”tube assay” effectu´e loin du seuil, comme c’est le cas ici, les tubes de membrane sont tir´es de fa¸con presque instantan´ee d`es que la v´esicule atteint la surface de la lamelle recouverte de MTs. Nous avons vu que, comme la tension de membrane est relativement ´elev´ee, le nombre de tubes tir´es par v´esicule n’est pas tr`es grand.

X Observations

Un exemple de tube tir´e `a partir d’une v´esicule est repr´esent´e figure 5.9. Sur cette image, il est int´eressant de remarquer l’accumulation de fluorescence au bout du tube correspondant `a une accumulation de moteurs. Ceci signifie que les moteurs s’associent au bout du tube pour tirer. Cette observation corrobore effectivement l’analyse th´eorique qui pr´evoit qu’une accumulation dynamique des moteurs doit avoir lieu au bout du tube pour que celui-ci soit tir´e (voir ch.3 §B.2.2).

vésicule

bout

tube de

membrane

Fig. 5.9 – Image (en vid´eomicroscopie de fluorescence) d’un tube de membrane tir´e `a partir d’une v´esicule par des kin´esines, dont les sites d’accrochage sont marqu´es en fluorescence. On observe l’accumulation de fluorescence et donc de moteurs au bout du tube qui se fait de fa¸con dynamique lorsque le tube est tir´e. Barre=2 µm.

Il est possible de prendre une s´erie d’images au cours de la croissance d’un tube pour caract´eriser sa dynamique. Typiquement, les s´equences que nous avons acquises ´etaient de 3 minutes `a la cadence d’une image prise par seconde, avec un temps d’exposition de 200 ms avec la cam´era CCD utilis´ee. Il ´etait difficile de descendre en dessous de cette cadence ´etant donn´ee la limitation m´ecanique

Chapitre 5. Etude exp´erimentale de l’extraction et de la croissance de tubes de membrane : Comparaison avec la th´eorie

li´ee `a l’ouverture et la fermeture de l’obturateur du microscope. Le montage de vid´eomicroscopie que nous avons utilis´e comporte un microscope invers´e Leica, muni d’une cam´era tr`es sensible (Micromax de chez Princeton Instruments, Trenton NJ) et pilot´e enti`erement par le logiciel Metamorph. La lumi`ere d’excitation ´etait fournie par une lampe `a vapeur de mercure er un jeu de filtres Cy3 (λexc= 510 −550 nm, λ_em = 550 − 590 nm). Un exemple de s´equence d’images obtenue est repr´esent´e figure 5.10.

Fig. 5.10 – S´equence d’images mon-trant le tube repr´esent´e figure 5.9 lorsqu’il croˆıt avec le temps. Ici, chaque image est espac´ee de 5 s mais il est possible de descendre jusqu’`a une cadence de 1 image/s. Barre=2 µm.

X N´ecessit´e d’utiliser une bonne cam´era

Pour observer en fluorescence les sites d’accrochage des moteurs sur un tube en train d’ˆetre tir´e, il ´etait n´ecessaire d’utiliser une cam´era tr`es sensible. En effet, on peut compter le nombre de fluorophores par micron de tube pour ´evaluer le niveau d’intensit´e des objets observ´es. Sur la v´esicule, ρ∞=0,1% soit 2.103 moteurs/µm2 et de plus, on peut ´ecrire la relation approch´ee entre les densit´es de moteurs le long du tube (loin des bouts) et ρ∞. Cette relation est obtenue en ´ecrivant les ´equations dynamiques qui r´egissent la r´epartition des moteurs li´es et non li´es dans chacune des r´egions du syst`eme, (dont la g´eom´etrie est rappel´ee fig. 5.11(B)) et en ´ecrivant les relations de continuit´e entre chaque r´egion (voir ch.3 §B).

ρ∞ b + ρ∞ u ≃ ρ∞ b kb k0 u+ kb = 2πR0ρ∞ (5.9)

En utilisant des valeurs typiques : – R₀=10 nm

– kb ≃5 s−1

– k0

u ≃0,5 s−1

on trouve que la somme des densit´es est de l’ordre de 120 moteurs par microns. Un pixel faisant 134 nm, on remarque qu’il n’y a qu’une quinzaine de fluorophores par pixel, d’o`u le besoin d’une cam´era tr`es sensible pour observer les inhomog´en´eit´es de fluorescence li´ees `a la dynamique des moteurs, et une source d’excitation des fluorophores adapt´ee. En effet, les observations de tubes effectu´ees avec un microscope confocal, utilisant un laser helium-n´eon (raie faible λ = 543 nm) pour exciter les rhodamines et un photomultiplicateur pour r´ecup´erer les photons ´emis

C. Etude aux temps longs de la dynamique de r´epartition des kin´esines le long d’un tube

par fluorescence, n’ont jamais permis de voir aucune inhomog´en´eit´e de fluorescence le long de tubes. On peut par exemple comparer les images 5.1(B) obtenue au confocal et 5.9 obtenue par vid´eomicroscopie exactement dans les mˆemes conditions de tension et de densit´e surfacique de moteurs.

C.1.2 Remarque sur l’angle entre la v´esicule et le tube de membrane On peut remarquer figure 5.9 que le tube pr`es de la v´esicule n’est pas au contact de la surface3. On comprend mieux cet ´ecart si on observe la figure 5.11(A) qui montre une vue de cˆot´e d’un tube de membrane tir´e `a partir d’une v´esicule. Cette vue de cˆot´e a ´et´e obtenue par microscopie confocale en faisant une s´erie d’images successives dans la direction perpendiculaire `a la surface des MTs et en reconstrui-sant en trois dimensions le syst`eme v´esicule-tube. Il suffit ensuite d’effectuer une projection dans le plan souhait´e. On voit que le tube fait un angle avec la surface contenant le r´eseau de MTs et la zone de contact avec la v´esicule, ce qui permet d’expliquer l’apparente ”d´econnection” du tube et de la v´esicule dans le plan d’ob-servation au niveau de la surface de lamelle et du r´eseau de MTs. En fait, cette connexion existe mais a lieu hors du champ d’observation.

L’analyse th´eorique tient compte de cette g´eom´etrie (fig. 5.11(B)). Cela avait per-mis de faire correctement les bilans de flux de moteurs li´es au niveau des diff´erentes r´egions du syst`eme.

L’origine de la formation de cet angle vient du fait que la position stable d’un tube de membrane correspond au cas o`u il est perpendiculaire `a la membrane (le prolongement de la direction du tube passe par le centre de la v´esicule). Ceci peut ˆetre observ´e par exemple sur la figure 5.11(A). La configuration o`u la connexion tube-v´esicule se fait au niveau de la surface de contact de la v´esicule avec la lamelle (sur le r´eseau de MTs), n’est observ´ee que lors de l’´etape de formation du tube, puisque la tr`es grande courbure au niveau de la connexion coˆute beaucoup d’´energie (voir la fl`eche fig. 5.12). Tr`es vite, cette g´eom´etrie n’est plus stable.

La valeur de l’angle de contact appel´e θ (fig. 5.11(B)) est d´etermin´ee par deux conditions :

1. L’axe du tube doit passer par le centre de la v´esicule.

2. L’´energie de courbure cr´e´ee au niveau du coude (passage zone II-zone III fig. 5.11(B)) doit ˆetre contrebalanc´ee par l’´energie d’adh´esion des moteurs li´es le long du tube. Si on appelle W l’´energie d’adh´esion des moteurs li´es par unit´e de longueur, l’angle doit v´erifier l’´equation suivante, qui r´esulte du bilan des forces au niveau du coude :

W = −F0(1 − cos θ) (5.10)

Cette ´energie est n´egative puisqu’elle correspond `a la force r´epulsive exerc´ee par les moteurs pour maintenir le tube au niveau de la connexion II-III. Cette force s’oppose

3

ainsi que le halo qui l’entoure li´e `a la grande profondeur de champs de l’objectif X100 utilis´e et la pr´esence du corps de la v´esicule au-dessus du plan d’observation

Chapitre 5. Etude exp´erimentale de l’extraction et de la croissance de tubes de membrane : Comparaison avec la th´eorie

A

B

θ

Fig. 5.11 – Angle de contact tube-v´esicule. (A) Image obtenue par microscopie confocale d’un tube de membrane tir´e `a partir d’une v´esicule. Une reconstruction 3D de l’objet puis une projection dans le plan perpendiculaire au plan des MTs passant par le tube ont ´et´e effectu´ees. Barre=2 µm. (B) Repr´esentation sch´ematique d’un tube de membrane tir´e. On distingue quatre r´egions : la v´esicule, la zone de connexion, le tube et le bout du tube.

Fig. 5.12 – Repr´esentation sch´ematique de l’extraction d’un tube. La connexion tube-v´escicule fait apparaˆıtre une zone de tr`es forte courbure rep´er´ee par la fl`eche.

`a la force qui aurait tendance `a d´etacher le tube qui, elle, est positive. Sachant que l’on a mesur´e des valeurs de θ autour de 25˚, que dans nos conditions exp´erimentales F0=27 pN, l’´energie W calcul´ee avec la formule 5.10 vaut : W = −2, 8.10−12 J/m. On peut v´erifier que cette description est coh´erente avec la distribution des moteurs que l’on a d´etermin´ee au-dessus. Si on suppose, en premi`ere approximation, que l’´energie d’adh´esion des moteurs le long du tube est donn´ee par la somme de l’´energie d’adh´esion de chaque moteur individuel, on a :

W ≃ ρbwm (5.11)

Cette description serait exacte si les moteurs ´etaient fixes. Or, ils avancent, ce qui peut cr´eer des effets de pression osmotique `a 2D dans la membrane

Sa-C. Etude aux temps longs de la dynamique de r´epartition des kin´esines le long d’un tube

chant que k0

u est petit devant kb on peut dire que la densit´e lin´eique totale des moteurs le long du tube est donn´ee par celle des moteurs li´es. On a donc ρb ≃ 120 moteurs/µm. De plus, l’´energie d’adh´esion par moteur v´erifie :

−wm KBT ^{= ln}  kb k0 u  (5.12) On peut donc calculer W en utilisant les ´equations 5.11 et 5.12, on a : W = −1, 2.10−12 J/m. ´Etant donn´e le caract`ere approximatif de l’´equation 5.11, on peut dire que la description de l’´energie d’adh´esion W du tube sur la surface en termes d’accrochage des moteurs le long du MT est raisonnable.

C.1.3 Coalescence de tube

Lorsque deux tubes sont tir´es de la mˆeme v´esicule et que la distance qui les s´epare n’est pas tr`es ´elev´ee (par exemple parce que les deux tubes sont tir´es le long d’un mˆeme MT), nous avons vu au ch.3 §A.3.4 que les tubes doivent coalescer. C’est en effet ce que nous avons observ´e exp´erimentalement (voir la s´equence d’images figure 5.13).

0 5 10

Fig. 5.13 – S´equence d’images montrant la coalescence de deux tubes tir´es `a partir de la mˆeme v´esicule. Images obtenues en microscopie de fluorescence, 1 image/5 s. Barre=2 µm.