A. Comparaison de la capture cérébrale de gadolinium chez le Rat sain et le Rat insuffi-
sant rénal (Publication 1)
1. Analyse rationnelle
Il s’agit ici d’une étude sur un modèle préclinique mimant une population potentiellement à risque : les pa- tients souffrant d’une insuffisance rénale modérée (c’est-à-dire jusqu’au stade 3 inclus). En effet, l’insuffi- sance rénale (IR) augmente la durée de résidence des produits de contraste dans l’organisme, menant jusqu’à la survenue de la fibrose systémique néphrogénique (FSN) dans les stades d’IR les plus sévères. L’insuffisance rénale modérée touche la majorité des patients âgés (Duru, 2009), qui représentent une proportion non négligeable des patients examinés quotidiennement en radiologie. L’hypothèse posée était que l’accumula- tion cérébrale de Gd chez cette catégorie de patient serait plus importante. Cela fait par ailleurs l’objet d’une des questions posées aux industries par les autorités de santé (FDA, 2015). Si les patients insuffisants rénaux s’avèrent plus concernés par l’accumulation cérébrale par rapport à des sujets sains, le modèle d’insuffisance rénale chez le Rat constituera un modèle sensibilisé cliniquement pertinent, ce qui pourrait permettre d’étu- dier plus facilement un phénomène amplifié (toxicité, discrimination de produits aux profils proches, etc.) L’insuffisance rénale modérée a été induite par une néphrectomie des 5/6e. Ce mode d’induction de l’insuf-
fisance rénale par réduction néphronique, très classique (Gretz, 1993), conduit à une chute de la fonction rénale plus stable et moins sévère que celle résultant d’un autre modèle fréquent, basé sur une alimentation enrichie en adénine, comme ont pu le démontrer des études préalables, réalisées au laboratoire dans le contexte de la FSN (Fretellier, 2013).
Dans un premier temps, nous avons étudié les effets du gadodiamide, produit de contraste linéaire non- ionique, le moins thermodynamiquement stable du marché, chez une population saine, dite « sham » (c’est- à-dire ayant subi une laparotomie suivie de la manipulation des reins, mais sans excision de ceux-ci, pour mimer l’acte chirurgical subi par les rats néphrectomisés) comparée à des rats en insuffisance rénale modé- rée. Des rats témoins néphrectomisés recevant des injections de sérum physiologique ont été inclus afin de renseigner les effets directement imputables à l’insuffisance rénale. La dose unitaire injectée a été choisie comme équivalente à la dose clinique, adaptée au Rat (sur la base de la surface corporelle). Un total de 20 injections ont été administrées, réparties sur 5 semaines (correspondant à plusieurs mois chez l’Homme) selon le protocole de l’étude préclinique princeps (Robert, 2015).
Notre objectif était l’approfondissement de nos connaissances sur l’accumulation cérébrale de Gd. Les mo- dèles précliniques permettent de ne pas se limiter à l’étude indirecte de l’accumulation de Gd par le seul rehaussement T1. Il a alors été décidé de suivre l’accumulation progressive du phénomène, au cours des injections, par examens IRM hebdomadaires, mais également, à l’issue de l’étude (une semaine après la fin des injections), de collecter différentes régions cérébrales et cérébelleuses, afin de documenter la réparti- tion du Gd, par dosage élémentaire. Il a notamment été décidé de mettre au point la dissection des noyaux cérébelleux profonds. Des prélèvements sanguins ont aussi été réalisés au cours de l’étude et à l’issue de celle-ci. Le dosage du Gd total ainsi que du Gd dissocié et soluble (par LC-ICP-MS) étant possible sur des matrices liquides, une première étude de la spéciation du Gd a été réalisée sur du plasma. Une autre ap- proche de la spéciation du Gd dans les matrices cérébrales a également été testée ex vivo, par
L’étude de la rétention tissulaire du Gd a ici été étendue à l’os. En effet, ce tissu est reconnu comme étant un compartiment important pour l’accumulation du Gd, et il a été avancé qu’il pourrait constituer un com- partiment profond dit « réservoir » de cet élément (Hirano, 1996 ; Lancelot, 2016), qu’il pourrait ensuite libérer progressivement dans la circulation sanguine. Certains auteurs avancent un stockage préférentiel du Gd dans l’os cortical (Vidaud, 2012 ; Thakral, 2007), d’autres dans la moelle osseuse (Lancelot, 2016 ; Drel, 2016). Dans le cadre de l’accumulation cérébrale de Gd, l’os pourrait ainsi participer au phénomène, surtout après l’arrêt des injections de chélate de Gd. L’intégration de ce paramètre nous est donc apparue nécessaire lors de la conception du protocole. Le prélèvement de deux types d’os (os compact et os spongieux) a ainsi été prévu, afin de documenter une potentielle accumulation préférentielle du Gd dans le tissu osseux et d’en définir le type.
Plusieurs rapports d’encéphalopathies, ou encore de pertes de connaissance et d’amnésie rétrograde chez des patients, souvent insuffisants rénaux, après administration unique d’un chélate de Gd ont été publiés (Rai, 2001; Bozzao, 2003; Hui et Mullins, 2009; Naganawa, 2014; Maramattom, 2005). Ils étaient associés à un rehaussement du LCR. Un lien avec la toxicité du Gd a été évoqué mais pas formellement établi. Néan- moins, chez un de ces patients, une concentration élevée (23 µmol/L) de Gd total a été mesurée dans le LCR (Hui et Mullins, 2009). Bien qu’il s’agisse là d’effets aigus, la recherche d’un hypersignal au niveau des ven- tricules cérébraux, ainsi que le dosage de Gd dans le liquide céphalorachidien prélevé à l’issue de l’étude nous sont apparus nécessaires. En effet, les informations tirées devraient permettre de renseigner la voie d’accès du Gd au tissu cérébral, cette dernière pouvant être différente chez l’insuffisant rénal, visiblement plus sensible au passage du Gd dans le LCR (sur la base des données cliniques citées plus haut).
Ces travaux ont fait l’objet de la publication suivante :
Rasschaert M, Idée JM, Robert P, Fretellier N, Vives V, Violas X, Ballet S, Corot C. Moderate renal failure accentuates T1 signal enhancement in the deep cerebellar nuclei of gadodiamide-treated rats. Invest Radiol. 2017; 52:255-264.
2. Méthodes
Pour quantifier le Gd dans un échantillon, les méthodes sont essentiellement basées sur la spectrométrie de masse. Nous décrivons ici les techniques analytiques utilisées dans cette étude. La première consiste simple- ment à ioniser l’échantillon pour une analyse élémentaire. On peut y adjoindre des techniques de séparation, comme la chromatographie, afin de quantifier la part de Gd soluble et dissociée de son chélate.
A. Spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS)
L’ICP est une méthode d’ionisation de l’échantillon, préalablement à la spectrométrie de masse.
La technique consiste en l’atomisation et l’ionisation d’un échantillon biologique par un plasma d’argon chauffé à plus de 6000°C. En effet, l’argon, soumis à un champ électromagnétique par une bobine d’induc- tion, subit des transitions électroniques, à l’origine de collisions, d’excitations et réactions d’ionisation en chaine au sein de l’échantillon. Cette méthode nécessite l’introduction de l’échantillon sous forme d’aérosol, par nébulisation, dans une torche à plasma d’argon. Les échantillons solides doivent donc au préalable être soit minéralisés (par l’acide nitrique par exemple), soit broyés dans un solvant afin d’en extraire les éléments d’intérêt dans la fraction soluble.
Comme son nom l’indique, la minéralisation consiste en la décomposition de la matière organique en matière minérale. C’est une étape essentielle de la préparation des échantillons biologiques, préalablement à l’ana- lyse élémentaire.
B. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-ICP-MS)
La LC-ICP-MS, ou chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, permet dans notre cas de renseigner la fraction dissociée et soluble de l’élément d’intérêt. La chromatographie liquide haute perfor- mance (HPLC) est ici associée à l’ICP-MS. Les molécules à séparer sont entraînées par la phase mobile liquide du chromatographe. Pour cela, l’échantillon ne doit pas être minéralisé, mais il doit être sous forme liquide. Cela limite donc l’analyse aux fluides biologiques (plasma, sérum, urine, liquide céphalorachidien…), ou bien nécessite la préparation préalable de l’échantillon solide, visant à l’extraction d’une fraction soluble analy- sable.
Figure 35 : Principe de l’ICP-MS couplée à l’HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) (Delafiori, 2016).