Deuxième étude : Analyse par fluorescence X de structures cérébelleuses de rats ayant reçus des injections multiples de gadobénate

A. Introduction

Les objectifs de cette deuxième étude sur la ligne de lumière Nanoscopium dédiée à l’imagerie X-dur étaient de reproduire et d’approfondir les observations précédentes, après optimisation du modèle. En effet, nous avons souhaité réduire l’épaisseur de l’échantillon pour un meilleur accès à la microanatomie, et avons mo- difié le mode de préparation de l’échantillon.

L’agent de contraste étudié ici est le gadobénate, un chélate de Gd linéaire ionique, associé à une accumula- tion de Gd cérébral plus faible que celui étudié précédemment (cf Publication 2). Nous avons souhaité étudier ici un tissu n’ayant pas été déshydraté, afin d’optimiser la concentration et la diversité des espèces de Gd observables. Les premières observations étaient en effet réalisées sur un échantillon inclus en résine, et donc supposé dépourvu de toutes les espèces solubles de Gd. De plus, plusieurs structures anatomiques d’intérêt ont été ici préparées : les noyaux cérébelleux profonds, mais aussi le cortex cérébelleux et les plexus cho- roïdes.

La potentielle colocalisation ou l’exclusion du Gd avec d’autres éléments endogènes a de nouveau été consi- dérée, et nous avons souhaité renseigner la morphologie ou l’ultrastructure des zones analysées, grâce au spectre d’absorption total, ou encore grâce à la technique de contraste de phase. Cela devait nous permettre l’identification des structures d’accumulation du Gd et/ou la localisation précise des dépôts de Gd dans les structures microanatomiques.

B. Matériel et Méthodes

Réalisation de l’expérimentation

Deux rats ont été inclus dans cette étude. Comme précédemment, il s’agissait de femelles (souche Sprague- Dawley, OFA, Charles River) ici âgées de 11 semaines lors des administrations intraveineuses des produits. Le produit de contraste testé a été le gadobénate. L’induction du modèle a été la même que précédemment (12 mmolGd/kg cumulés). Les administrations ont été suivies d’un ou trois mois de « wash-out » (1 rat/durée). A l’issue de cette période post-injection, une euthanasie par exsanguino-perfusion cardiaque de sérum phy- siologique puis de PFA 4% a été réalisée, sous anesthésie gazeuse.

Préparation des échantillons

Le cervelet prélevé a été fixé pendant la nuit dans du glutaraldéhyde 2,5% - tampon cacodylate 0,1M. Après un rinçage par le tampon cacodylate, le cervelet a été découpé en tranches de 150 à 300 µm à l’aide d’un vibratome. L’épaisseur des coupes a été choisie comme un compromis entre une épaisseur suffisante pour la détection de Gd, mais permettant l’accès à l’ultrastructure de l’échantillon et sa corrélation aux cartogra- phies élémentaires obtenues. Sur ces coupes, les zones d’intérêts ont été sectionnées en zones de 2 à 3 mm de côté. Ces échantillons ont été placés dans des supports (décrits ci-dessous) préparés au préalable, main- tenu hydraté dans tampon cacodylate, et refermés de façon relativement hermétique.

Préparation du support pour fluorescence X

L’échantillon devant être présenté verticalement, collé sur un support horizontal, nous avions choisi, dans la première étude, de coller un bloc de résine façonné, à l’aide de vernis à ongle. Ici, nous

voulions travailler sur un échantillon ayant subi peu de préparation et maintenu hydraté à l’aide d’un tampon cacodylate de sodium. Pour ce faire, nous avons, dans un premier temps, pensé aux membranes de nitrure de silicium utilisées sur la ligne de lumière pour l’étude de cultures cellulaires. Il s’agit d’une structure rigide de silicium contenant une fenêtre ouverte recouverte d’un film de nitrure de silicium. Cependant, le choix des dimensions était limité (fournisseur Silson : http://www.silson.com), et consistait en des fenêtres de 200 µm d’épaisseur au maximum (ce qui était trop faible pour nos coupes prévues jusqu’à 300 µm). De plus, les côtés biseautés, peuvent interférer avec les détecteurs et ainsi être la source d’artefacts lors de l’analyse. Nous avons donc décidé de fabriquer nos propres supports à fenêtres, en polymère PEEK (polyétheréthercé- tone), à l’aide d’une imprimante 3D dont dispose Nanoscopium. La fenêtre est refermée de part et d’autre de façon étanche (sur l’échantillon) par une membrane de Kapton (polyimide) fixée au support à l’aide de colle cyanoacrylate.

Figure 69 : Support en PEEK obtenu par impression 3D, recouvert d’un film de Kapton (polyimide) (jaune). Les dimensions de la fenêtre ainsi obtenues sont de 3 µm x 3 µm, pour une épaisseur d’environ 300µm.

Etude histologique

Après l’analyse en fluorescence X, les échantillons ont été inclus en paraffine afin de procéder à l’étude his- tologique.

Les échantillons ont été déshydratés puis inclus en paraffine. Un bloc de paraffine contenant la coupe

d’échantillon a ensuite été coupé au vibratome (coupes sériées de 7 µm) pour l’histologie. Les coupes ont été déparaffinées et réhydratées.

Certaines lames ont été dédiées à une coloration par hématoxyline-éosine, tandis que d’autres au marquage immunohistologique CD34 (« cluster of differentiation 34 », une glycoprotéine d’adhésion), pour le mar- quage de l’endothélium des vaisseaux sanguins (anticorps anti-CD34, Lapin, Abcam ab81289), suite à un dé- masquage antigénique au four à micro-ondes.

C. Résultats

Analyse de l’échantillon par fluorescence X

Les conditions d’expérimentation ont été similaires à celles de l’étude précédente : énergie de 9 keV pour se placer au-dessus du niveau d’énergie d’activation de la couche L de l’élément Gd.

- Un premier scan assez large (400 µm x 400 µm), non optimal en termes de résolution et de sensibilité (300 ms et 1 µm de pas) a été réalisé, sur une zone choisie aléatoirement dans la structure d’étude.

- Si du Gd est observé et s’il ne s’avère pas être distribué de façon homogène (bruit de fond), mais accumulé en une petite structure, un second scan, plus résolu et centré à ce niveau a été effectué. Sinon, on a réitéré l’opération un peu plus loin. Après plusieurs scans sans succès, on change de structure ou d’échantillon. Nous avons dû faire face à différents obstacles au cours des différents essais :

-Les éléments observés (outre le Gd) étaient répartis de façon très homogène au sein des zones scannées. Nous nous attendions à ce que leur distribution reflète l’ultrastructure microanatomique de l’échantillon, cela n’a pas été le cas.

-Le sodium et le potassium n’ont pas pu être observés. Il est apparu que les énergies attendues pour ces éléments étaient dans la fenêtre d’absorption du Kapton (perte d’intensité liée à l’absorption du signal de fluorescence dans les 12,5µm de Kapton).

-Nous avons donc inclus un échantillon en résine pour comparer la distribution de ces éléments endogènes (puisqu’une telle observation n’avait pas été faite lors de la 1e _{étude sur résine). Il est alors apparu que la}

résine utilisée ici contenait du cobalt (ce qui n’est pourtant pas indiqué dans sa composition). Comme indiqué dans la première étude, le pic du cobalt se superposait au 2e _{pic du Gd, qui était celui que nous prenions en}

compte principalement pour la cartographie du Gd (le 1e _{pic étant superposé au le Ca endogène et le 3}e _avec

le Mn). Nous avons donc poursuivi l’analyse de nos échantillons maintenus hydratés.

En procédant ainsi, nous avons observé, à différentes reprises, dans la zone des noyaux cérébelleux profonds, des structures fines et allongées, accumulant particulièrement du Gd (Figure 70 et Figure 71). La forme de ces structures suggère de nouveau qu’il s’agit de vaisseaux sanguins.

La recherche de colocalisation du Gd avec différents éléments endogènes (Fe, Zn, Cu, Mn, Cl, Ca, P, S) s’est révélée positive pour le calcium (Figure 70 et Figure 71). Alors que du calcium est observé de façon relative- ment homogène dans l’échantillon, on observe sa colocalisation avec le Gd sur différentes portions de la structure allongée. Il n’y a pas de doute qu’il s’agit bien de calcium et non d’un artéfact d’interprétation, car les pics d’énergie ne se recoupent absolument pas avec ceux du Gd. Les différentes analyses n’ont pas permis d’observer des structures de type vasculaire ne contenant que du calcium.

Figure 70 : Cartographie élémentaire du Gd (A), du Ca (B), et de leur superposition (C) (jaune-orangé quand fusionné avec le logiciel ImageJ) de l’échantillon G (300 µm d’épaisseur) (zone de 150x100 µm).

Figure 71 : Cartographie élémentaire du Gd (A), du Ca (B), et de leur superposition (C) (jaune-orangé quand fusionnées avec le logiciel ImageJ) de l’échantillon C (150 µm d’épaisseur) (zone de 100x150 µm).

Les quelques scans larges réalisés sur la zone corticale du cervelet n’ont pas révélé la présence de dépôts de Gd, et nous ne nous sommes donc pas attardés sur cette structure. Les plexus choroïdes n’ont pas non plus pu être étudiés dans le créneau disponible sur la ligne Nanoscopium.

Figure 72: Image de l’échantillon G obtenue grâce à la caméra utilisée pour centrer le faisceau sur une zone d’intérêt. Le scan sur lequel du Gd a été identifié apparait en rouge. Deux scans réalisés au préalable (en vert et bleu) ont permis de délimiter cette zone d’intérêt.

Recherche de l’ultrastructure par contraste de phase et absorption

La ligne Nanoscopium permet, en plus de la fluorescence X, de renseigner sur la composition structurelle de l’échantillon. Les techniques de contraste de phase différentiel et de spectre d’absorption ont ainsi été utili- sées pour caractériser notre échantillon au niveau des dépôts observés. La Figure 73 présente les résultats obtenus pour l’échantillon C. Malheureusement, l’épaisseur de nos coupes, couplée certainement à une com- position du tissu examiné probablement trop homogène, n’ont pas permis la visualisation de structures mi- croanatomiques.

Figure 73 : Spectre d’absorption (B) et contraste de phase horizontal (C) et vertical (D) obtenus sur la partie haute de la zone de l’échantillon C (scan stoppé à 67%) (A). On croit peut-être repérer la structure en forme de Y dans le cadre B, sans plus d’informations.

Histologie

Suite à l’échec des études de la morphologie des zones analysées et bien que les échantillons aient été main- tenus hydratés pendant plusieurs jours dans leur montage, une analyse histologique a été envisagée. L’inclu- sion en paraffine de l’échantillon G de 300 µm a été effectuée, mais celle de l’échantillon C, de 150 µm seu- lement, n’a pas permis l’étude histologique ultérieure.

La zone bombardée par le faisceau synchrotron est parfaitement visible sur les coupes après coloration HE. En effet, une coloration bien plus marquée est observée dans les régions correspondant aux scans de longue durée de bombardement du faisceau pour l’analyse par fluorescence (Figure 74). Quelques noyaux autour d’une structure paraissant allongée sont visibles. Il peut s’agir d’une portion du vaisseau, réparti en profon- deur parmi les différentes coupes de l’échantillon. Cependant, la coloration HE seule ne nous permet pas d’affirmer qu’il s’agit bien d’un vaisseau sanguin. Les coupes successives n’ont pas permis d’obtenir une meil- leure identification de cette structure.

Un marquage de la molécule de surface CD34, a été choisi pour l’identification de l’endothélium vasculaire, bien que celle-ci ne soit pas entièrement spécifique (elle marque en effet les cellules souches hématopoïé- tiques (Civin, 1984) et endothéliales (Baumhueter, 1994) mais aussi les cellules dendritiques ou des fibro- blastes (Sidney, 2014)). Idéalement, il aurait fallu faire un co-marquage avec les protéines d’adhésion CD31 ou CD146. Les essais d’immunomarquage CD34, bien que validés sur des échantillons de cerveau de Rat, ont échoué dans nos conditions expérimentales (autofluorescence du tissu, ou bien masquage de la fluores- cence). Nous pensons que la fixation initiale de l’échantillon par le glutaraldéhyde (plutôt qu’avec du para- formaldéhyde, classiquement préconisé pour l’histologie), est à l’origine d’un masquage antigénique diffici- lement réversible. En effet, l’histologie n’avait pas été initialement envisagée lors de la conception de l’étude. Le glutaraldéhyde est connu pour altérer la structure protéique du tissu (il provoque une réticulation des protéines), ce qui réduit fortement l’accès des réactifs aux sites antigéniques (Mrini, 1995). Il existe des pistes de démasquage après une telle fixation au glutaraldéhyde (Tagliaferro, 1997), mais, à cause du faible nombre de coupes encore disponibles, nous n’avons pas jugé judicieux de tenter de nouvelles mises au point. Il fau- drait refaire l’ensemble de l’expérimentation, avec une fixation au PFA pour qu’une histologie postérieure puisse confirmer la nature de ces structures d’accumulation de Gd observées de façon récurrente.

D. Conclusion

Sur ces échantillons de cervelet de rats traités par des administrations répétées de gadobénate, des struc- tures d’accumulation de Gd fines et allongées ont été observés à plusieurs reprises dans la zone des noyaux cérébelleux profonds. Une observation cohérente avec celle-ci avait été faite lors de la première étude de fluorescence X. Cela renforce notre hypothèse qu’il s’agit de microvaisseaux sanguins. Une bonne colocalisa- tion a été observée avec le calcium. Cette observation n’avait pas été faite dans l’étude précédente, peut- être à cause d’un mode différent de préparation de l’échantillon. Nous avons travaillé ici sur des échantillons très peu préparés afin de nous affranchir au maximum d’un lavage des entités solubles de Gd, pour observer éventuellement de nouvelles structures d’accumulation de Gd. Cela n’a pas été le cas.

Nous avons tenté d’accéder à l’ultrastructure de l’échantillon sur la ligne Nanoscopium, par l’étude du spectre d’absorption du faisceau, ainsi que par le contraste de phase. Cela n’a pas fourni d’informations ex- ploitables. Cela est certainement lié à la superposition de microstructures sur toute l’épaisseur de l’échantil- lon.

Une étude histologique a alors été réalisée, après inclusion ultérieure des échantillons en paraffine, et re- coupe en coupes sériées plus fines. Cependant, une coloration HE simple n’a pas permis une bonne visuali- sation des structures observées, certainement dispersées parmi les différentes coupes sériées. Un marquage spécifique des vaisseaux par la protéine CD34 a été réalisé, mais s’est avéré non-spécifique. Nous pensons que la fixation initiale du cervelet au glutaraldéhyde est à l’origine d’un masquage antigénique.

DISCUSSION des résultats concernant la caractérisation de la rétention cérébrale de Gd