Administration de 36mmolGd/kg cumulées de gadodiamide, et suivi sur 5 mois post-injec tions

A. Méthodes

Modèle d’étude

L’étude a été réalisée sur des rats femelles Spague-Dawley (OFA, Charles River). Les rats étaient initialement âgés de 6 semaines et pesaient entre 180 et 200 g.

Les rats ont reçu soit une solution saline NaCl 0,9% (300mOsm/kg d’eau) (3,6 mL/kg), soit du gadodiamide (Omniscan®) à la dose de 1,8 mmolGd/kg, à raison de 4 injections par semaine pendant 5 semaines, par voie intraveineuse dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse. Cela correspond à une dose cumulée adminis- trée de 36 mmolGd/kg. La dose de Gd reçue à chaque injection de gadodiamide correspond à 3 fois la dose clinique.

Suivi d’un potentiel rehaussement du signal T1 par IRM

Les IRM ont dans un premier temps été réalisées en début de semaine, avant les injections de la semaine, et 3 jours (vendredi-samedi-dimanche) après la dernière injection, sur n=6 rats/groupe. Le suivi IRM s’est pour- suivi une fois la période des injections passée, une fois par mois. Les images ont été obtenues sur un imageur Biospec® Bruker 4,7 T.

Après anesthésie des animaux à l’isoflurane (4% pour l’induction, 3% dans l’IRM), les rats sont installés dans l’IRM. Les séquences sélectionnées ont été les suivantes :

 Localizer : Image de repérage pour le positionnement des coupes

 Flash pondérée T1 : Temps de répétition/temps d’écho (TR/TE) = 50/1.782 ms; nombre de répétitions (NR) = 48 ; résolution de 164 x 164 µm² ; épaisseur de coupe de 700 µm ; temps d’acquisition (Tacq) = 6 mn36 s ; ciblé sur le cervelet (11 coupes).

 Cartographie T1 (réalisée sur la coupe contenant les DCN) FAIR-RARE (« flow-sensitive alternating inversion recovery – rapid acquisition with relaxation enhancement ») : TR/TEeffectif = 36.9 ms/2079.9 ms ; NR=4; résolution 164 x 164 µm², épaisseur de coupe 700 µm ; Tacq = 11 mn 05 s ; avec 8 temps d’inversion (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1200, 2000 ms).

Les images obtenues en Flash pondérée T1 ont, par la suite, été « anonymisées », randomisées (randomisa- tion par rat et par temps) pour une cotation qualitative en aveugle du rehaussement des noyaux cérébelleux profonds (DCN), selon une échelle de 0 à 2 :

 1 : prise de contraste probable  2 : prise de contraste notable

Une seule fois, trois mois et demi après la période d’injections, une acquisition IRM a été réalisée à plus haut champ, au laboratoire MIRCen (CEA, Fontenay-aux-Roses) sur une IRM Bruker Biospec® 11,7 T, sur n=10/groupe.

Les séquences réalisées ont été les suivantes :

 Localizer : Image de repérage pour le positionnement des coupes

 Cartographie T2* : Résolution = 125x125x500 μm3_{, 15 coupes de 500 µm, TR/TE = 800 ms / 3 ms,}

avec 10 temps d’écho (de 3 à 30 ms)

 Cartographie T2 : Résolution = 250x250x500 μm3_{, 15 coupes de 500 µm, TR/TE = 3000 ms / 6,5 ms,}

avec 10 temps d’écho (de 6,5 à 104 ms)

Pour la cotation quantitative sur les images obtenues avec la séquence flash pondérée T1 et les cartogra- phies, des régions d’intérêt (ROI) ont été dessinées pour délimiter les DCN, ainsi qu‘une zone de référence (le tronc cérébral) au moyen du logiciel GOA (Guerbet Oriented Analysis) codé au laboratoire sous MATLAB (The Mathworks Inc. Natick, MA, USA). Les rapports d’intensité de signal des zones d’intérêt ont ensuite été calculés pour quantifier une éventuelle prise de contraste des DCN.

Euthanasies, dissection et dosages

Suite à l’euthanasie par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale, le cerveau a ensuite été prélevé et finement disséqué sous binoculaires pour récupérer les structures suivantes, en vue du dosage de Gd :

 Cervelet,

 Bulbes et tubercules olfactifs,  Striatum,  Cortex cérébral,  Hypothalamus,  Mésencéphale,  Thalamus,  Plexus choroïdes,  Hippocampe,  Amygdale.

Le cervelet a ensuite été placé dans une matrice à encoches (Brain Slicer®). Des tranches de 0,5 ou 1mm ont été réalisées, puis délicatement disséqué afin de séparer le cortex cérébelleux, les DCN, le tronc cérébral, et les plexus choroïdes.

Les dosages de Gd total, quelle que soit sa forme (chélatée, complexée avec une macromolécule, libre) ont ensuite été effectués sur les diverses structures cérébrales prélevées par ICP-MS (réalisée sur l’appareil 7700x ; Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Pour cela, les échantillons ont été minéralisés par de l’acide nitrique 65%, en bain marie à 80°C pendant 8h. Une courbe standard de Gd inorganique (0,05–100 μg/L) dans de l’acide nitrique 6,5% a été réalisée, suivant la réponse de l’isotope 158_{Gd. La limite inférieure}

de quantification de la concentration du Gd total est de 0,2 nmol/g pour les DCN, 0,5 nmol/g pour les plexus choroïdes, et 0,02 nmol/g de tissu dans les autres matrices cérébrales.

A. Résultats

Relaxations T1, T2 et T2*

Les résultats de la cotation qualitative, présentés en Figure 36 A, montrent une prise de contraste T1 notable des DCN chez le groupe traité par le gadodiamide versus le groupe témoin. L’apparition de l’hypersignal T1 chez les rats traités par le gadodiamide se fait de façon progressive et une différence significative avec le groupe témoin apparaît dès 3 semaines d’injections (semaine 4) (p < 0,0001) (Figure 36 B). La vitesse de relaxation R1 calculée dans le DCN depuis les cartographies présente une valeur initiale de 1,32 ± 0,02 s-1

pour les témoins, se maintenant jusqu’à la fin de l’étude (1,33 ± 0,02 s-1_{), contre1,31 ± 0,01 s}-1_{, augmentant}

progressivement jusqu’à 1,38 ± 0,02 s-1 _{pour le gadodiamide (Figure 36 C).}

Figure 36 : (A) Cotation qualitative des IRM. La cotation a été faite sur un score de 0 à 2 (0 : aucun rehaussement des DCN, 1 : rehaussement probable, 2 : rehaussement notable) ; (B) Rapport de l’intensité de signal mesuré dans les DCN ramené à celle du tronc cérébral ; (C) R1 calculé dans les DCN d’après la cartographie T1. Les IRM de tous les rats (n=6 rats/groupe) et des différents délais ont été anonymisées et randomisées pour une lecture en aveugle.

Des cartographies T2 et T2* ont également été réalisées. La pose d’une ROI au niveau du DCN de l’hémis- phère droit, du cortex cérébelleux et du tronc cérébral des rats sur les cartes T2 et T2* a permis le calcul des

37. Le temps de relaxation T2 moyen dans les DCN est de 28,9 ± 0,5 ms dans le groupe gadodiamide alors qu’il est de 32,6 ± 0,8 ms dans le groupe témoin (Figure 37 A). Les 2 groupes présentent donc des temps de relaxation T2 significativement différents (p < 0,0001).

De même, le temps de relaxation T2* moyen dans les DCN est de 16,3 ± 1,1 ms dans le groupe gadodiamide et de 20,0 ± 1,5 ms dans le groupe témoin (Figure 37 B). Les groupes présentent également des T2* signifi- cativement différents (p = 0,0001). Ce raccourcissement significatif des temps de relaxation T2 et T2* dans les DCN des rats traités par le gadodiamide est retrouvé, de façon moins nette mais toujours significative, dans le cortex cérébelleux (Figure 37 C et D). Dans le tronc cérébral cependant, les valeurs de T2 et T2* sont similaires pour les deux groupes (Figure 37 E et F).

Ces différences entre les temps de relaxation T2 et T2* sont également visibles de façon individuelle (en particulier sur la carte T2), comme l’illustre la Figure 38.

Figure 37 : Temps de relaxation individuels (T2 et T2*) mesurés dans le DCN droit, le cortex cérébelleux et le tronc cérébral pour les deux groupes à haut champ (11,7 T) et au délai M3 chez des rats traités par le gadodiamide ou du sérum physiologique (n=10 rats/groupe).

Figure 38 : Exemple de cartes T2 et T2* obtenues pour un rat de chaque groupe (à un champ magnétique de 11,7 T). Le groupe gadodiamide présente une diminution des temps de relaxation T2 et T2* des DCN qui se traduit par un hyposignal.

Concentrations de Gd total dans les structures cérébrales

Le dosage de la concentration de Gd total a été réalisé sur les structures cérébrales disséquées à l’issue de la microdialyse, en semaine 20 (juste avant M4, 4 mois post-injections). La grande majorité des concentrations de Gd total dosées pour le groupe témoins sont inférieures à la limite de quantification (0,02 nmol/g), mon- trant une contamination négligeable lors de l’expérimentation et la dissection (Figure 39). Pour le groupe gadodiamide, c’est dans les bulbes olfactifs que l’on trouve la plus haute concentration (26,1 ± 4,0 nmol/g dans les bulbes olfactifs, 21,2 ± 4,3 nmol/g dans les DCN). Le striatum, comprenant le globus pallidus, trop petit chez le Rat pour pouvoir être disséqué, est en 3ème position (17,9 ± 3,9 nmol/g). On note, juste après le striatum, les plexus choroïdes, avec une variabilité relativement importante, mais des concentrations no- tables (13,2 ± 6,4 nmol/g). Le tronc cérébral est la région étudiée pour laquelle la concentration de Gd total était la plus faible pour le groupe gadodiamide (3,5 ± 1,7 nmol/g).

Figure 39 : Détermination du Gd total par ICP-MS, dans les différentes structures disséquées. Cervelet* indique la totalité du parenchyme cérébelleux sauf les DCN.

B. Conclusions

L’analyse des images d’IRM a révélé une augmentation croissante et franche du R1 (donc un T1 raccourci) dans les noyaux cérébelleux profonds. Après la période d’injection, le rapport du signal T1 DCN/tronc céré- bral a semblé légèrement diminuer après un mois, mais la valeur de la vitesse de relaxation R1 a semblé se maintenir, voire augmenter. Les temps de relaxation T2 et T2* ont également été raccourcis de façon signi- ficative dans les DCN, 3 mois après les injections.

Les concentrations de Gd total sont très hétérogènes d’une structure cérébrale à l’autre, avec toujours glo- balement le même ordre d’accumulation (cf. Publication 2). Cependant, les bulbes olfactifs se sont ici révélés plus riches en Gd que les DCN, contrairement à ce que nous avions noté (pour une dose de gadodiamide plus faible et chez le Rat insuffisant rénal) dans l’étude 2 (cf. Publication 2).

2. Administration de 50 mmolGd/kg cumulées de gadodiamide ou de gadotérate, et suivi sur 4