Chapitre 2 : Matériels et Méthodes
1. Traitement cellulaire et test de cytotoxicité
1.1. Culture cellulaire des lignées cellulaires A549 et HepG2
1.1.1. Agents génotoxiques utilisés
Le composé BPDE (0477, MRI Global) est solubilisé dans 5% de triéthylamine (TEA) et 95% de tétrahydrofurane (THF) à une concentration stock de 7.36 mM. Il est conservé à -20°C en aliquots.
Le B[a]P (B1760, Sigma) est dilué dans du diméthylsulfoxide (DMSO) à une concentration stock de 40 mM. Il est conservé à -20°C en aliquots à l’abri de la lumière.
Le CAA (31727, Sigma) est reçu en solution à une concentration de 6.4 M. Il est conservé à +4°C.
L’IFO (I4909, Sigma) est mis en suspension dans H2O MilliQ à une concentration stock de 192 mM. Il est conservé à -20°C en aliquots.
1.1.2. Culture cellulaire
Nous avons sélectionné deux modèles cellulaires qui nous ont semblé pertinents pour étudier l’exposition à ces quatre agents génotoxiques.
La première lignée cellulaire est la lignée HepG2 (HB-8065, ATCC) qui est issue d’un hépatocarcinome humain. Rappelons que le foie joue un rôle primordial dans la métabolisation des xénobiotiques dû à la présence de nombreuses enzymes de phase I (CYP1A1, 1A2, 2B6, 2E1) et II (GST, SULT, UGT, …) (Wilkening et al., 2003). Cette lignée est donc très souvent utilisée pour ses bonnes capacités de métabolisation des progénotoxiques.
La deuxième lignée cellulaire est la lignée A549 (300 114, Cell Line Service) qui provient d’un adénocarcinome pulmonaire. Cette lignée exprime certaines enzymes du métabolisme de phase I (CYP1A1, 1B1, 2B6) et II (GST) (Hukkanen et al., 2000) nécessaires à la métabolisation des progénotoxiques. De plus, une des voies principales d’exposition au B[a]P et au VC est la voie respiratoire. Cette lignée cellulaire représente donc un bon modèle d’exposition pour cette étude.
118
Nous détaillerons également une troisième lignée cellulaire, la lignée Huh7 fournie par le Pr Janet HALL, CRCL Lyon. Cette lignée a été utilisée pour l’optimisation de la conception de la puce.
1.1.2.1. Lignée cellulaire HepG2
Les cellules sont cultivées dans le milieu DMEM/F12 (21331-020, Gibco) dans lequel sont ajoutés 10% de sérum de veau fœtal (SVF) non décomplémenté (10270-106, Gibco), 1% d’acides aminés non essentiels (11140-035, Gibco), 2% de GlutaMAXTM (35050-038, Gibco), 1% de sodium pyruvate à 100 mM (11360-039, Gibco) et 0.02% d’antibiotique contenant de la pénicilline à 5 000 unités/mL et de la streptomycine à 5 000 µg/mL (15070-063, Gibco). Ces cellules adhérentes sont cultivées en monocouche grâce à un traitement préalable des flasques et pétris avec du collagène de type I (A10483- 01, Gibco) dilué au 1/50e dans un mélange stérile NaOH 1N/D-PBS/H
2O (2.5/10/87.5%). Pour leur entretien, les cellules sont repiquées deux fois par semaine au 1/5e à l’aide de 0.01% de Trypsine-EDTA (25300-062, Gibco) dans des flasques de 75 cm2. Les cellules sont incubées à 37°C sous 5% de CO
2. 1.1.2.2. Lignée cellulaire A549
Les cellules sont cultivées dans le milieu DMEM/F12 dans lequel sont ajoutés 10% de SVF non décomplémenté, 1% d’acides aminés non essentiels, 1% de L-Glutamine à 200 mM (25030-024, Gibco) et 0.02% d’antibiotique contenant de la pénicilline à 5 000 unités/mL et de la streptomycine à 5 000 µg/mL. Pour leur entretien, les cellules sont repiquées deux fois par semaine au 1/10e à l’aide de 0,01% de Trypsine-EDTA dans des flasques de 75 cm2. Les cellules sont incubées à 37°C sous 5% de CO
2. 1.1.2.3. Lignée cellulaire Huh7
Les cellules sont cultivées dans le milieu DMEM/F12 dans lequel sont ajoutés 10% de sérum de veau fœtal (SVF) non décomplémenté, 1% d’acides aminés non essentiels, 1% de GlutaMAXTM, 1% de sodium pyruvate à 100 mM et 0.02% d’antibiotique contenant de la pénicilline à 5 000 unités/mL et de la streptomycine à 5 000 µg/mL. Pour leur entretien, les cellules sont repiquées deux fois par semaine au 1/10e à l’aide de 0,01% de Trypsine-EDTA dans des flasques de 75 cm2. Les cellules sont incubées à 37°C sous 5% de CO2.
1.1.3. Congélation et décongélation des cellules
Les cellules sont congelées en cryotubes par culot de 1 million de cellules dans 1 mL de milieu de cryoconservation (SVF avec 10% de DMSO). Les cryotubes sont placés dans un Bicell pendant 24h à - 80°C avant d’être conservés dans l’azote liquide jusqu’à leur utilisation. Lors de la décongélation, les aliquots sont rapidement décongelés et centrifugés pendant 3 min, à 1 500 g afin d’éliminer le DMSO.
119
Les cellules sont ensuite ensemencées dans des flasques de 75 cm2 contenant 15 mL de milieu complet qui sera renouvelé le lendemain, une fois que les cellules auront adhéré.
1.1.4. Détection de mycoplasme
Après chaque décongélation, et pour les deux lignées cellulaires utilisées, la recherche de mycoplasme est réalisée via le kit de détection MycoAlertTM (LT07-318, Lonza). Il n’a jamais été détecté de mycoplasmies pour ces deux lignées cellulaires au cours de notre étude.
1.2. Test de cytotoxicité MTT
Les sels de tétrazolium MTT (bromure de 3- [4,5-diméthyl-2-thiazolyl] -2,5 diphényltétrazolium) permettent d’évaluer la cytotoxicité des composés génotoxiques. En effet, les déshydrogénases mitochondriales présentes dans les cellules vivantes et actives vont entrainer la précipitation des sels en formazan sous forme de cristaux bleus-violets. Ces cristaux de formazan sont ensuite dissous dans du DMSO qui donne une coloration violette analysable par spectrophotométrie. L’absorbance mesurée est proportionnelle au nombre de cellules vivantes.
Afin d’effectuer ce test, les cellules sont ensemencées en plaque de 96 puits à 2 000 ou 4 000 cellules par puits. Les traitements avec les différents agents génotoxiques sont effectués 24h après l’ensemencement. Une solution de MTT (M5655, Sigma) à 5 mg/mL est préparée dans du D-PBS (14200- 094, Gibco) puis aliquotée et conservée à -20°C à l’abri de la lumière. A la fin du traitement avec les agents génotoxiques, 10 µL de solution de MTT sont ajoutés par puits contenant 100 µL de milieu complet. Les cellules sont incubées pendant 2h à 37°C sous 5% CO2. La plaque est ensuite centrifugée à 200 g, pendant 5 min. Les puits sont vidés et rincés avec 200 µL de D-PBS, puis 100 µL de DMSO sont ajoutés par puits. La plaque est placée dans un agitateur pour microplaques à 700 rpm pendant 15 min avant d’être lue au spectrophotomètre à 560 nm.
L’absorbance témoin correspond à un échantillon cellulaire non traité. Le blanc de lecture correspond au test réalisé sur les puits contenant du milieu complet seul. Le pourcentage de viabilité cellulaire est exprimé par la formule suivante :
𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡é 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑢𝑙𝑎𝑖𝑟𝑒 (%) =(𝐷𝑂𝑒− 𝐷𝑂𝑏) (𝐷𝑂𝑡− 𝐷𝑂𝑏)
× 100
DOe: absorbance de l’échantillon
DOt : absorbance du témoin
120
1.3. Traitement cellulaire avec les différents agents génotoxiques
Les deux lignées cellulaires sont traitées avec les quatre agents génotoxiques (B[a]P, BPDE, IFO et CAA) pendant 24 ou 48h de traitement. Le déroulement des expériences cellulaires est décrit dans le schéma suivant :
Les cellules sont ensemencées à une densité adaptée au temps de traitement de manière à ce qu’au moment de la récolte, elles soient confluentes à 80%.
Lors de l’ensemencement, les cellules sont placées dans 9 mL de milieu complet dans des pétris de 100 mm. Le traitement débute 24h après l’ensemencement en ajoutant, dans chaque pétris, 1 mL de milieu de culture dans lesquels les différents agents génotoxiques ont été dissous à la concentration souhaitée. Etant donné que les composés BPDE et B[a]P sont très peu solubles dans l’eau, ils sont préalablement dilués dans du DMSO. La concentration finale en DMSO est de 0.5% pour le B[a]P et 0.2% pour le BPDE.
Chaque expérience inclut un ou deux contrôles en fonction des agents génotoxiques utilisés :
- Les expériences comprenant les traitements au CAA et à l’IFO ne possèdent qu’un seul contrôle non traité correspondant aux cellules placées dans du milieu de culture complet
- Celles incluant les traitements au B[a]P et au BPDE comprennent deux contrôles : un contrôle non traité (milieu de culture complet) et un contrôle DMSO correspondant aux cellules avec du milieu complet et une concentration en DMSO de 0.5 ou 0.2% selon l’agent génotoxique utilisé
121
1.4. Récolte cellulaire
Après 24 ou 48h de traitement avec les composés, les cellules sont rincées deux fois avec 5 mL de D- PBS puis décollées avec 1 mL de 0.01% Trypsine/EDTA. L’action de la trypsine est stoppée par l’ajout de 5 mL de milieu de culture. Les cellules sont récoltées en tube Falcon de 15 mL puis centrifugées pendant 5 min, à 1 500 g. Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire est repris par 1 mL de SVF. La viabilité cellulaire ainsi que le nombre de cellules sont comptabilisés à l’aide du compteur automatique (Countess automated cell counter, Invitrogen). Le volume de SVF est ensuite ajusté afin de permettre la préparation de deux aliquots par condition : un contenant 2.5 millions de cellules, destiné à la préparation d’extraits protéiques pour le test ExSy-SPOT et un autre avec 5 millions de cellules, destiné à l’extraction de l’ADN pour le dosage par HPLC-MS/MS. Les cellules sont congelées comme décrit précédemment par ajout de 10% de DMSO et conservées dans l’azote liquide jusqu’à leur utilisation.