Introduction

Ce chapitre présente les résultats de la réponse cellulaire à deux agents progénotoxiques et de leurs métabolites. Il sera divisé en deux parties en fonction de l’agent utilisé. Chaque partie suit la même démarche expérimentale que nous allons détailler ci-dessous.

1. Démarche expérimentale pour l’optimisation de la conception de la puce

Dans le but d’obtenir des informations sur la spécificité des mécanismes de réparation de l’ADN sollicités suite à l’exposition génotoxique, nous allons construire deux nouveaux substrats plasmidiques qui vont contenir les lésions d’intérêt en relation avec les agents génotoxiques que nous allons étudier.

L’objectif est de former par réaction chimique un type de lésion donné dans le substrat plasmidique, qui sera ensuite immobilisé sur la biopuce, avec les substrats déjà disponibles (8oxoG, AbaS, CPD-64 et Glycols). Pour cela, nous utilisons un agent chimique correspondant au métabolite qui va réagir avec l’ADN (CAA ou BPDE) pour entrainer la formation des lésions d’intérêt (Ethénobases ou adduits du BPDE) dans le plasmide.

Il est ensuite nécessaire de vérifier le nombre et la nature des lésions formées par l’agent génotoxique.

Pour cela, d’une part, nous quantifions le nombre de lésions spécifiques formées par HPLC-MS/MS.

D’autre part, nous recherchons d’autres lésions non spécifiques susceptibles d’avoir été créées au cours de la réaction chimique. Deux techniques sont utilisées :

- Le dosage HPLC-MS/MS pour la quantification des lésions oxydatives de type 8oxoG très facilement créées au cours de réactions chimiques à cause de la susceptibilité de la Guanine à l’oxydation et à la présence d’oxygène.

- L’électrophorèse sur gel d’agarose qui permet de s’assurer de l’absence de cassures et donc de l’intégrité du plasmide. Plus précisément, nous vérifions que la forme superenroulée du plasmide est conservée à plus de 85%. Les formes relaxées et linéaires indiquent la présence de cassures simple et double brin.

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Une fois que les conditions expérimentales de formation des lésions spécifiques sont établies et validées (concentration en agents génotoxiques, temps, température, …), le plasmide correspondant est immobilisé sur la puce.

Nous devons ensuite vérifier que le signal de fluorescence qui sera obtenu suite à la réparation par des extraits de ce plasmide sera suffisant et d’intensité équivalente aux signaux obtenus au niveau des autres substrats immobilisés. Ce signal de fluorescence dépend de la quantité de lésions présente sur le plasmide et de l’efficacité de la voie de réparation ciblée.

Nous conduisons donc une réaction d’excision/resynthèse par incubation d’extraits protéiques dans des conditions standards. Si le résultat n’est pas satisfaisant, nous revoyons les conditions expérimentales de préparation des substrats plasmidiques, pour ajuster la quantité de lésions formées.

Nous suivons ainsi une démarche en boucle entre les conditions de traitement du plasmide et la réaction d’excision/resynthèse (Figure 60).

Figure 60 - Démarche expérimentale de préparation des substrats plasmidiques contenant les lésions d’intérêt

2. Démarche expérimentale pour l’étude des conséquences de l’exposition aux agents génotoxiques

Pour l’étude de la réponse cellulaire suite à l’exposition aux différents agents génotoxiques, nous nous sommes intéressés à deux aspects : l’analyse des lésions formées et l’analyse de la réparation de l’ADN. Pour cela, nous avons utilisé deux techniques :

- Le dosage des lésions formées par HPLC-MS/MS - Le test de réparation de l’ADN (ExSy-SPOT)

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La quantification des lésions formées est une méthode directe pour évaluer l’exposition cellulaire à un agent génotoxique. Elle est aujourd’hui considérée comme une des méthodes de référence pour étudier la génotoxicité de substances endogènes ou exogènes.

Par ailleurs, nous souhaitons mieux comprendre quel peut être l’apport de la mesure de la réparation de l’ADN dans les études d’exposition à des génotoxiques, dans une perspective d’identification de biomarqueurs.

Nous avons exploré trois paramètres que nous évaluerons pour ces deux outils :

1) La réponse cellulaire et sa variabilité

Pour explorer la variabilité cellulaire, nous avons choisi deux lignées cellulaires appropriées pour cette étude en termes de modèle d’exposition et de capacités de métabolisation.

Notre choix s’est porté sur l’utilisation de lignées cellulaires humaines du fait de leur facilité d’utilisation, de leur division rapide et de leur durée de vie importante. Plusieurs lignées cellulaires sont utilisées dans le cadre de l’étude de la toxicité des agents génotoxiques (HEL, BEAS-2B, Caco-2, …). Nous avons sélectionné deux modèles cellulaires différents : les lignées cellulaires A549 et HepG2 dont les caractéristiques de métabolisation ont été décrites précédemment.

2) Le seuil de la réponse cellulaire

Ce paramètre nous permet d’évaluer la dose la plus faible à partir de laquelle nous observons un effet sur la formation des lésions et la réparation de l’ADN. Afin d’identifier ce seuil, nous avons choisi trois doses : IC20, IC20/10 et IC20/50. La dose IC20 est déterminée par l’utilisation du test de viabilité cellulaire MTT. Cette dose correspond à la concentration en agent génotoxique entrainant 20% de mortalité cellulaire. Cette dose a été préférée à l’IC50 car idéalement, elle correspond à un faible niveau de toxicité pouvant induire une réponse spécifique à travers l’évaluation de la signature enzymatique de réparation. De plus, l’IC20 permet la formation de dommages à l’ADN sans entrainer une mort cellulaire de type apoptose ou nécrose excessive qui conduirait à des niveaux élevés de nucléases.

Dans le cadre de cette étude, ces trois doses seront utilisées à deux temps de traitement : 24 et 48h. Ces deux temps correspondent à des temps classiquement utilisés pour évaluer la génotoxicité de composés. De plus, des tests préliminaires ont permis d’observer des effets plus marqués à ces deux temps de traitements qu’à des temps plus courts (résultats non présentés).

146 3) La spécificité de la réponse cellulaire

L’objectif de ce dernier paramètre est d’examiner la relation entre l’agent génotoxique, les lésions formées et les voies de réparation.

Pour cela, nous avons décrit dans le premier chapitre les caractéristiques des différents agents que nous avons sélectionnés ; nous avons suivi au cours du traitement la formation des lésions formées dans l’ADN cellulaire par dosage HPLC-MS/MS ; puis dans un dernier temps, nous avons incubé les différents extraits protéiques avec le test ExSy-SPOT afin d’obtenir différents profils de réparation.

Ces différentes informations ont été analysées et regroupées afin de déterminer si la spécificité des lésions formées par HPLC-MS/MS et la signature enzymatique de réparation nous permet de discriminer la nature de l’agent génotoxique étudié et la dose d’exposition.

Par ailleurs, pour chaque agent génotoxique, nous avons utilisé leur précurseur nécessitant une étape de métabolisation préalable par les cellules avant de former des lésions dans l’ADN. Cette démarche permet d’évaluer si le nombre de lésions formées et les signatures enzymatiques de réparation varient ou non en fonction de cette étape de métabolisation.

En fonction des signatures enzymatiques de réparation obtenues, nous discuterons de l’identification possible de nouveaux biomarqueurs suite à une exposition.

La démarche expérimentale de cette deuxième partie que nous venons de décrire est résumée ci- dessous :

Figure 61 - Démarche expérimentale pour l’exploration de la réponse cellulaire ainsi que les paramètres évalués en vue d’identifier des biomarqueurs

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