Mesure des activités de réparation par réaction in vitro d’excision/resynthèse

Pour quantifier les activités de réparation de l’ADN, le support fonctionnalisé est incubé avec l’extrait protéique d’intérêt, en présence de réactifs favorisant la réaction de réparation par excision/resynthèse.

3.3.1. Préparation des extraits protéiques nucléaires

Pour réaliser le test ExSy-SPOT, nous devons en amont préparer les extraits afin d’obtenir les protéines nucléaires de chaque échantillon. Pour cela, nous utilisons les culots cellulaires préparés et conservés dans les conditions décrites précédemment.

L’ensemble des étapes de la lyse est réalisé à 4°C. Les cellules sont centrifugées à 500 g pendant 5 min puis lavées au PBS 1X avant d’être incubées 20 min dans le tampon A afin de lyser la membrane plasmique (Tableau 10 pour la composition). A la fin de l’incubation, les cellules sont agitées pendant

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30 sec pour faciliter la lyse membranaire ; puis centrifugées à 2 300 g pendant 5 min afin de culotter les noyaux intègres et d’éliminer les protéines cytoplasmiques situées dans le surnageant. Le culot est ensuite repris dans le tampon B (Tableau 10 pour la composition) pendant 20 min permettant de procéder à la lyse de la membrane nucléaire. La lyse des noyaux est complétée par deux cycles congélation/décongélation, 30 sec dans l’azote liquide puis à 4°C pendant 2 min. Les tubes sont centrifugés 10 min à 16 000 g afin de séparer les débris membranaires, des protéines nucléaires localisées dans le surnageant. L’extrait protéique est ensuite aliquoté et conservé à -80°C jusqu’à son utilisation.

Tableau 10 - Composition des tampons de lyse A et B pour la préparation des extraits protéiques nucléaires

3.3.2. Dosage de protéines dans les extraits

La concentration en protéine des extraits est déterminée par dosage BCA à l’aide du kit Uptima MicroBC Protein Quantification Assay (UP75860A, Interchim) en plaque 96 puits. La méthode BC Assay est un dosage colorimétrique des protéines basé sur l’utilisation d'acide bicinchoninique (BC). Les protéines réduisent l'ion cuivrique Cu2+ _{en Cu}+ _{en milieu alcalin. Or, l'acide bicinchoninique est un réactif} colorigène hautement spécifique pour le Cu+_{, qui forme un complexe pourpre ayant une absorption} optique maximale à 562 nm. L'absorbance est proportionnelle à la concentration de protéines.

Une gamme étalon est donc préparée à partir d’une solution de BSA à 2 mg/mL ainsi que 3 dilutions en cascade de chaque extrait à doser. 100 µL de réactif MicroBC assay sont ensuite ajoutés dans chaque puit. La plaque est incubée 1h à 60°C. L’absorbance est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre (SpectraMax M2, Molecular Devices). La concentration en protéines de chaque extrait est déterminée à partir de la courbe étalon.

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3.3.3. Réaction in vitro d’Excision/Resynthèse à partir de l’extrait protéique

Lors de l’expérience de réparation sur la puce, un cache en plastique (HBW14FL-2L, Grace Biolabs) est collé sur chaque lame (Figure 55). Ce cache permet de délimiter des chambres réactionnelles où un extrait protéique peut réagir avec l’ensemble des plasmides déposés dans un pavé. Un mix réactionnel de 12 µL est déposé dans chaque chambre réactionnelle grâce à des orifices présents sur le cache au niveau des extrémités de chaque pavé.

Figure 55 - Schéma de la préparation de la biopuce pour la réalisation de la réaction in vitro d’excision/resynthèse

Le test ExSy-SPOT impose certains paramètres expérimentaux qui ont été établis lors des précédents travaux de J.F Millau (Millau, 2006). Par exemple la dernière étape de lyse des membranes nucléaires pour la préparation des extraits nécessite une forte concentration en KCl (400 mM). Les protéines se retrouvent alors dans un tampon avec une forte concentration saline. Or, pour que la réaction d’excision/resynthèse soit optimale, la concentration en KCl doit être de 80 mM ce qui nous contraint à diluer par 5 tous les extraits et ce qui a également des conséquences sur les concentrations finales en protéines.

Chaque échantillon est déposé en duplicats sur la puce, nous préparons donc un mix réactionnel de 30 µL contenant :

- 6 µL d’extraits protéiques nucléaires à la concentration finale comprise entre 0.1 et 0.6 mg/mL dilué dans le tampon B ayant servi pour la préparation des extraits,

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- 6 µL de tampon ATG 5X (220 mM HEPES-KOH, 35 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 1.25 µM dATP, 1.25 µM dGTP, 1.25 µM dTTP, 17% Glycérol, 50 mM Phosphocréatine, 10 mM EDTA-NaOH, 250 µg/mL Créatine Phosphokinase, 0.5 mg/mL BSA),

- 0.75 µL dCTP-Cy3 à 10 µM, - 0.3 µL ATP 100 mM, - qsq H2O MilliQ.

Les concentrations finales de chaque réactif sont présentées dans le tableau suivant :

Tableau 11 - Concentration finale en réactifs lors du test ExSy-SPOT

Dans les conditions classiques du test ExSy-SPOT, nous utilisons du dCTP-Cy3 (PA53021, GE Healthcare) mais il est également possible en fonction des besoins de l’étude d’utiliser les trois autres dNTPs marqués (dGTP, dATP et/ou dUTP).

Après avoir déposé le mix réactionnel sur chaque pavé, un film autocollant de protection est collé sur le cache afin de boucher les orifices et éviter ainsi toute évaporation. La lame est incubée pendant 3h à 30°C en chambre humide.

A la fin de l’incubation, la lame est rincée 2 fois 3 min dans du PBS/Tween 0.05% ; puis 2 autres fois dans H2O MilliQ. Afin d’éliminer l’eau résiduelle, la lame est centrifugée pendant 30 sec à 800 g puis séchée pendant 10 min à 30°C.

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La fluorescence incorporée au niveau de chaque dépôt de plasmide (spot) est quantifiée en utilisant un scanner (Innoscan 710 AL, Innopsys).

La lecture de l’intensité de fluorescence nécessite le réglage de plusieurs paramètres que nous pouvons contrôler et ajuster en fonction des besoins :

- la puissance du laser peut être définie indépendamment. Le scanner que nous utilisons possède un laser à 532 nm pour la mesure du Cy3.

- le réglage du gain de détection c’est-à-dire la puissance du photomultiplicateur du scanner détermine le pourcentage de gain de chaque longueur d’onde. La modification de ce paramètre permet d’éviter la saturation des pixels. Nous l’utilisons à gain 15 pour chaque lecture de lame. - le contrôle du focus : nous l’utilisons en mode « autofocus » ce qui permet de réduire très

fortement le bruit de fond et d’être insensible aux possibles déformations de la lame.

Tous ces paramètres sont réglables grâce au logiciel Mapix (version 6.5) et il nous permet d’obtenir les intensités de fluorescence totale de chaque spot, en unités arbitraires (A.U.).