Méthodes indirectes basées sur la mesure des lésions

Les techniques que nous allons présenter dans cette partie permettent de quantifier les lésions présentes dans l’ADN. Ces méthodes peuvent permettent également de suivre la cinétique de réparation des lésions en observant la disparition des lésions. Pour cela, il suffit de mesurer la présence des lésions à des temps différents après une exposition aigüe.

77 5.1.1. Test des comètes

Le test des comètes (Single Cell Electrophoresis Assay) a été décrit pour la première fois dans les années 80 et permet de mesurer les cassures simple brin et double brin ainsi que les sites alcali-labiles (sites AP, certaines bases alkylées) de l’ADN dans des conditions alcalines. Cette technique d’électrophorèse sur gel d’agarose permet de détecter des fragmentations de l’ADN de cellules individualisées. Pour cela, les cellules sont suspendues dans un gel d’agarose et un traitement à base de détergents et de sels permet de lyser les membranes. L’ADN des cellules chargé négativement va migrer vers le pôle positif du champ d’électrophorèse. Le marquage au bromure d’éthidium (BET) permet de révéler l’ADN : les noyaux intacts forment une sphère compacte contrairement à l’ADN endommagé qui, de par la présence de cassures, va migrer et ainsi prendre l’aspect d’une comète. La visualisation des fragments d’ADN s’effectue au microscope à fluorescence. La taille et l’intensité de la queue des comètes sont directement proportionnelles au nombre de cassures présentes dans l’ADN nucléaire.

Figure 30 - Principe du test des comètes (Genies, 2013)

Il existe une version modifiée du test des comètes qui permet de déceler spécifiquement certaines lésions oxydatives par l’utilisation d’enzyme de la réparation (ADN N-glycosylases). Ces enzymes vont entrainer l’excision de la base oxydée et former une cassure simple brin (Collins, 2004). Par exemple, l’utilisation de l’enzyme Fpg permet de détecter les purines oxydées dont la 8oxoG et Endo III est utilisée pour les pyrimidines oxydées comme les diols de Thymine (Collins et al., 1993, 1996).

Cette technique est très utilisée en biosurveillance par exemple pour évaluer les capacités de réparation de l'ADN après irradiation in vitro de lymphocytes de sujets exposés professionnellement ou non aux IR. Elle présente de nombreux avantages et inconvénients qui sont les suivants :

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Avantages Inconvénients

➢ nécessite peu de cellules (entre 400 et 2 000)

➢ peu coûteux

➢ simple à mettre en œuvre en laboratoire

➢ sensible (environ 1 cassure pour 108 bases)

➢ approche cellule par cellule

➢ technique applicable à un grand nombre de types cellulaires, de tissus et

d’organismes

➢ pas d’information relative à la

quantification du nombre de dommages ➢ manque de spécificité dû à l’absence

d’information sur la nature des dommages mesurés

➢ limiter à l’analyse de lésions qui génèrent des cassures simples brins ➢ l’analyse est longue et ne permet pas

d’effectuer des expériences en haut débit

➢ variations inter et intra-laboratoires (Ersson et al., 2013)

Tableau 4 - Tableau récapitulatif des avantages et inconvénients du test des comètes

5.1.2. Chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en

mode tandem (HPLC-MS/MS)

Cette technique permet la détection des bases modifiées par séparation des molécules après ionisation en fonction du rapport masse/charge. L’analyse par HPLC-MS/MS nécessite deux étapes préliminaires si les échantillons de départ sont des cellules : une première étape d’extraction de l’ADN puis l’hydrolyse de l’ADN en nucléosides.

L’appareil est composé de deux parties : une première comportant de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) qui permet la séparation des composés d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification. Les composés à séparer sont mis en solution dans un solvant puis introduits dans la phase mobile liquide. La phase mobile poussée par une pompe haute pression, parcourt le système chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire. La deuxième partie est constituée du spectromètre de masse (MS/MS) et permet d’ioniser les molécules qui sont éluées à la sortie de la colonne HPLC afin de pouvoir les séparer en fonction du rapport masse/charge (m/z).

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- Une source d’ionisation où les molécules séparées par le système HPLC sont vaporisées et passent en phase gazeuse. Il va y avoir formation de petites gouttelettes et les molécules se retrouvent alors ionisées. Cela permet également d’éliminer des molécules neutres comme les solvants. Cette étape s’effectue avec une ionisation douce à pression atmosphérique grâce à l’électrospray.

- Un analyseur qui sépare les ions en fonction de leur rapport m/z. En effet, le quadripôle va permettre de filtrer les ions en fonction du rapport m/z. Afin d’obtenir une sensibilité importante, le système est généralement composé de trois analyseurs de type quadripôle. Le premier quadripôle Q1 sélectionne l’ion d’intérêt (ion parent) de la molécule ; le deuxième correspond à la cellule de collision (Q2) qui va fragmenter cet ion par collision avec un gaz neutre (argon ou azote) ; puis le dernier (Q3) va sélectionner le ou les ions (ions fils) issus de la fragmentation de l’ion parent. C’est grâce à l’utilisation de ce mode MRM (Multiple Reactions Monitoring) que la sensibilité et la spécificité de détection sont importantes.

- Un détecteur qui transforme les ions en signal électrique.

Nous avons détaillé ici la source d’ionisation de type électrospray couplé à un analyseur triple quadripolaire car ceci correspond au matériel que nous avons utilisé dans le cadre de ce projet. Cependant, il existe plusieurs types de sources d’ionisation et d’analyseurs mais qui sont moins adaptés pour la quantification des lésions à de faible concentrations.

Les données sont ensuite traitées et permettent d’identifier et de quantifier le nombre de lésions présentes dans l’échantillon. La quantification est possible grâce à des standards internes (enrichis isotopiquement) et/ou externes à une concentration connue. La détection d’une lésion va nécessiter la mise au point d’une méthode qui va être propre à chaque lésion. Cette mise au point s’effectue à partir d’un standard afin d’identifier les ions fils et d’optimiser l’ionisation et la fragmentation. La limite de détection dépend de la sensibilité de détection ainsi que de la quantité d’ADN.

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Figure 31 - Schéma d'une source d'ionisation électrospray couplée à un analyseur quadripôles (adaptée de Marie, 2007)

Comme toute technique, elle comporte des avantages et des inconvénients qui sont présentés dans le tableau ci-dessous :

Avantages Inconvénients

➢ grande sensibilité si l’ionisation et la fragmentation est efficace

➢ grande spécificité obtenue grâce au MS/MS en mode MRM

➢ versatilité puisqu’il peut détecter simultanément plusieurs molécules ➢ quantitative

➢ coût élevé à l’achat de l’appareil estimé entre 200 000 et 300 000 euros

➢ nécessité de préparer des standards internes ou externes ce qui n’est pas toujours facile de réaliser par synthèse chimique

➢ étape d’extraction et de digestion enzymatique de l’ADN qui peut entrainer l’oxydation artéfactuelle de l’échantillon

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