Chapitre 2 : Matériels et Méthodes
2. Dosage des lésions par HPLC-MS/MS
2.1. Extraction de l’ADN cellulaire
Tous les produits composant les tampons A et B ainsi que la solution de NaI proviennent de Sigma.
Les échantillons préparés lors de la récolte cellulaire sont décongelés et centrifugés 5 min à 1 500 g. Le surnageant est éliminé et les cellules sont reprises dans 1 mL de PBS. Une nouvelle centrifugation est effectuée ; puis le culot est repris et homogénéisé dans 0.75 mL de tampon A afin de procéder à la lyse des membranes plasmiques (Tableau 9 pour la composition). Les échantillons sont ensuite centrifugés pendant 5 min à 1 500 g. Cette étape d’ajout de tampon A et de centrifugation est répétée une seconde fois.
Le culot nucléaire est remis en suspension dans 0.3 mL de tampon B afin de lyser les membranes nucléaires (Tableau 9 pour la composition).
Après homogénéisation, 18 µL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % sont ajoutés puis les échantillons sont homogénéisés par vortex. Dans chaque tube, 1.5 µL de RNAse A à 100 mg/mL (R5125, Sigma), 3.5 µL de RNAse T1 à 1 U/mL (R1003, Sigma) sont ajoutés afin d’éliminer l’ARN. Les échantillons sont incubés pendant 15 min à 50°C ; puis pendant 1h à 37°C après addition de 15 µL de protéase (19157, Qiagen) de manière à supprimer les protéines.
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L’ADN est précipité par ajout de 0.5 mL de solution de NaI (Tableau 9 pour la composition) et de 1 mL d’isopropanol 100%. Après agitation douce par retournement et centrifugation de 5 min à 5 000 g, les culots sont repris dans 0.5 mL d’éthanol 70%. Une dernière centrifugation est effectuée puis l’éthanol est éliminé avant de dissoudre l’ADN dans 50 µL de déféroxamine à 0.1 mM. Les échantillons sont conservés à -20°C jusqu’à la prochaine étape de digestion.
Tableau 9 - Composition des tampons de lyse A et B et de la solution de NaI utilisés pour l'extraction d'ADN
2.2. Digestion enzymatique de l’ADN
Tous les produits composant les tampons proviennent de Sigma.
L’ADN cellulaire ou les substrats plasmidiques (utilisés pour le test ExSy-SPOT que nous détaillerons plus bas) sont digérés enzymatiquement en nucléosides selon un protocole commun divisé en deux étapes.
Pour cela, un premier mélange d’enzyme est préparé contenant 0.025 U de Phosphodiestérase II (P9041, Sigma), 2.5 U de DNase II (D4138, Sigma), 0.5 U de Nucléase P1 (N8630, Sigma) et 2.5 µL de tampon MNSPDE 10X (200 mM d’acide succinique, 100 mM CaCl2, pH 6). Celui-ci est ensuite ajouté à chaque échantillon suivi d’une incubation de 2h à 37°C.
Un nouveau mix est ajouté constitué de 0.015 U de Phosphodiestérase I (P3243, Sigma), 2 U de Phosphatase alcaline (P6774, Sigma) et 6 µL de tampon (500 mM Trizma® base, 1 mM EDTA, pH 8). Après 2h d’incubation à 37°C, 3.5 µL d’HCl à 0.1N sont ajoutés afin de neutraliser la solution. Les échantillons sont ensuite centrifugés à 5 000 g pendant 5 min puis ils sont placés pendant 10 min au speed-vac à trompe à eau (SPD 111V, Thermo Scientific) pour éliminer toutes traces d’éthanol. L’ADN hydrolysé est conservé à -20°C jusqu’à l’analyse HPLC-MS/MS.
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2.3. Analyse HPLC-MS/MS
2.3.1. Solvants
Les solvants utilisés pour l’analyse HPLC-MS/MS sont l’acétonitrile (83639.320, VWR), le méthanol (34860, Sigma), le formiate d’ammonium à 10 M (78314, Sigma) ainsi que l’acide formique (85175, Thermo Scientific). Les solutions de formiate d’ammonium sont préparées à 2 mM et celles d’acide formique à 0.1%. Elles sont ensuite filtrées sur membrane 0.45 µm.
2.3.2. Synthèse des adduits et appareils utilisés
Afin de pouvoir quantifier le nombre de lésions formées dans l’ADN, nous procédons à une calibration externe, il est donc nécessaire d’analyser des standards à une concentration connue. Ces différents types de standards correspondent d’une part, à un mélange équimolaire de nucléosides non modifiés (dA, dG, dT et dC) et d’autre part, aux différentes lésions que nous souhaitons doser sous forme de nucléosides. La synthèse des différents adduits (8oxodGuo, BPDE-N2-dGuo, εdA, εdC et εdG) est effectuée par le laboratoire SyMMES selon différents protocoles comme décrits précédemment par Marie et al., (Marie et al., 2008), Stadler et al. (Stadler et al., 1994),Badouard et al. (Badouard et al., 2008). Les trois Ethénonucléosides sont analysés en mélange équimolaire.
Deux systèmes sont disponibles au laboratoire pour le dosage de ces différents adduits. Ils sont composés d’une chaine HPLC couplée en ligne à un spectrophotomètre de masse en mode tandem (MS/MS). La source d’ionisation est de type électrospray et l’analyseur est constitué d’un triquadripôle utilisé en mode MRM. Pour les deux appareils, la séparation HPLC est réalisée sur une colonne de silice greffée en phase inverse C18 (UP3ODB-150/021, Interchim).
2.3.3. Analyse des lésions Ethénonucléosides et 8oxodGuo
Le premier appareil (Accela couplé à TSQ Quantum Ultra, Thermo Scientific) permet les dosages des lésions Ethénonucléosides et 8oxodGuo.
Le dosage des Ethénonucléosides est effectué par calibration externe dans les divers échantillons. La séparation est réalisée avec un gradient de méthanol de 0 à 25% en 30 min dans du formiate d’ammonium 2 mM. Trois transitions spécifiques à chaque Ethénonucléosides sont suivies :
124 - εdA avec la transition MRM : 276 160 - εdC avec la transition MRM : 252 136
Figure 48 - Fragmentation de l’εdG
Le temps de rétention est compris entre 13 et 14 min selon le type d’Ethénonucléosides. La quantification des nucléosides non modifiés est réalisée en UV à 280 nm. La calibration externe basée sur l’injection du standard composé du mélange de εdA, εdC et εdG à une concentration connue permet d’effectuer la quantification et d’exprimer les résultats en nombre d’Ethénonucléosides (εdA, εdC et εdG)/106 nucléosides normaux.
Le dosage de la 8oxodGuo est effectué par étalonnage interne en ajoutant un standard de 8oxodGuo 15N
5, c’est-à-dire enrichi isotopiquement en azote 15, dans chaque échantillon. Cet enrichissement permet de s’affranchir de toute perte de sensibilité qui pourrait advenir au cours de l’analyse. La séparation est réalisée avec un gradient de méthanol de 0 à 15% en 25 min dans de l’acide formique 0.1%. Deux transitions sont simultanément suivies :
- 8oxodGuo avec la transition MRM : 284 168 - 8oxodGuo 15N
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Figure 49 - Fragmentation de la 8oxodG
Le temps de rétention est de 24 min pour la 8oxodGuo et l’étalon interne. La quantification des nucléosides non modifiés est réalisée par détection UV à 280 nm. Les résultats sont exprimés en nombre de 8oxodGuo/106 nucléosides normaux.
Pour cet appareil, toutes les données sont traitées grâce au logiciel Xcalibur.
2.3.4. Analyse des adduits BPDE-N2-dGuo
Le deuxième dispositif (Agilent couplé à API300, SCIEX) permet le dosage des adduits BPDE-N2-dGuo.
La séparation est réalisée avec un gradient d’acétonitrile de 0 à 100% dans du formiate d’ammonium 2 mM. Trois transitions correspondant à des fragmentations spécifiques de l’adduit BPDE-N2-dGuo ont été sélectionnées (Figure 50) et sont simultanément suivies avec les transitions MRM : 570 454 ; 570 285 et 570 257.
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Le temps de rétention des adduits BPDE-N2-dGuo est de 21 min. La quantification des nucléosides non modifiés est réalisée en UV à 280 nm. La calibration externe basée sur l’injection du standard à une concentration connue permet d’effectuer la quantification et d’exprimer les résultats en nombre d’adduits BPDE-N2-dGuo/106 nucléosides normaux.
Toutes les données sont traitées grâce au logiciel Analyst.