Techniques de biologie moléculaire

2.1. Invalidation de CD274 par technique d’édition du génome

L’établissement de la lignée humaine MDA-MB-231 knock-out pour le gène CD274 codant la protéine PD-L1 a été réalisé en utilisant la stratégie d’édition du génome par les Zinc

Finger Nucleases [CompoZR Zinc Finger Nuclease (ZFN), kit CKOZFN5707] (Sigma-Aldrich)

(Annexe 2). Les plasmides ZFN ont été transfectés selon le protocole décrit ci-dessus pour la lignée MDA-MB-231. Après 72 heures, temps nécessaire pour que la cassure double brin soit induite par les ZFN sur le gène CD274 et la réparation homologue effectuée, les cellules CD274/PD-L1-négatives sont isolées à l’aide du trieur BD FACSAria III (Becton Dickinson). Pour cela, les cellules ont été marquées au préalable avec un anticorps anti-CD274/PD-L1 humain marqué PE (clone MIH1) ou avec un anticorps contrôle isotypique marqué PE (Thermo Fisher Scientific). A partir de ce bulk de cellules CD274/PD-L1-négatives, des clones cellulaires ont été isolés en plaques 96 puits en utilisant le module d’autoclone du trieur BD FACSAria III. Chaque puits contient 100 µL de milieu conditionné pendant 24h et provenant de la culture de la lignée parentale, filtré sur membrane 40 µm (Corning). Les clones cellulaires ont été amplifiés après vérification au microscope Leica DMi1 (Leica Microsystems) de la présence d’une seule cellule par puits. Pour chaque clone cellulaire obtenu, la région de l’exon 3 du gène CD274 ciblée par les ZFN a ensuite été séquencée par la méthode Sanger (GATC) et analysée grâce au logiciel Chromas® version 1.43 (Technelysium Pty Ltd). De cette manière, six clones contenant des mutations homozygotes à l’origine d’un décalage de la séquence de lecture ont été identifiés. L’invalidation a également été confirmée par

Dans l’objectif d’étudier les fonctions de l’isoforme 1, deux clones cellulaires MDA-MB-231

CD274-KO ont été transfectés avec un plasmide vide contrôle ou avec le même plasmide

codant l’isoforme 1 de la protéine PD-L1 (respectivement, EX-NEG-M10 et EX-U0767-M10 ;

GeneCopoeia). Les cellules ont ensuite été sélectionnées avec de la néomycine à 1,2 mg/mL

pendant 10 à 15 jours puis des clones cellulaires ont été isolés en plaques 96 puits comme décrit précédemment. L’intégration du plasmide vide a été validée par PCR, en utilisant des amorces spécifiques du gène de résistance à la néomycine (sens : 5’-CTTGGGTGGAGAGGCTATTC-3’ ; anti-sens : 5’-AGGTGAGATGACAGGAGATC-3’). L’intégration du plasmide codant PD-L1 a été validée par Western-blot et cytométrie en flux. Pour chaque transfection, six clones cellulaires validés ont tout d’abord été mis en culture seuls, pour ensuite générer des bulks à partir de 106 cellules de chaque clone. Ces bulks correspondent aux lignées cellulaires MDA-MB-231-VIDE (« VIDE ») et MDA-MB-231-PD-L1-iso1 (« PD-L1 »). Enfin, ces deux lignées ont été authentifiées par analyse STR (Short

Tandem Repeat) réalisée par la société LGC Standards (Teddington).

2.2. Amplification des plasmides

2.2.1. Transformation bactérienne

Dans le but d’obtenir des quantités importantes de plasmides, nécessaires pour générer des lignées cellulaires transfectées de manière stable, une transformation de bactéries compétentes Escherichia coli Top10 est réalisée (Thermo Fisher Scientific). Pour cela, 2 ng de plasmide purifié sont ajoutés à 100 µL de bactéries et incubés 20 minutes sur glace, suivi d’un choc thermique de 90 secondes à 42°C afin de perméabiliser les parois bactériennes et permettre la pénération du plasmide. Après une incubation de 5 minutes sur glace, les bactéries sont cultivées en milieu SOC (Invitrogen) pendant 45 minutes à 37°C ; cela favorise l’expression de la cassette de résistance portée par le plasmide. 160 µL de cette solution bactérienne est étalée sur milieu Luria-Bertani gélosé (LB Broth, Thermo Fisher

Scientific) avec 1,5% d’agar et contenant de l’ampicilline (50 μg/ ml), puis incubée une nuit à 37°C. L’une des colonies bactériennes obtenues est ensuite mise en culture pendant 8 heures à 37°C et sous agitation à 125 rpm, dans du milieu LB/antibiotique.

2.2.2. Isolement et linéarisation des fragments d’ADN

La purification de l’ADN plasmidique est réalisée grâce au kit Nucleobond® Xtra Midi (Macherey Nagel) selon les recommandations du fournisseur. Afin de faciliter l’intégration stable du vecteur dans les cellules après transfection, celui-ci doit être au préalable linéarisé. Pour cela, 20 µg de plasmide purifié sont digérés par 100 U d’enzyme DraIII (New England

bromure d’éthidium, agent intercalant de l’ADN, la migration est faite dans du tampon TBE 1X (tris borate EDTA) pendant 40 minutes à 30 mV. Le produit de digestion correspondant au fragment d’ADN linéaire est ensuite excisé à l’aide d’un scalpel et l’ADN est purifié à l’aide du kit PCR and Gel Extraction Kit (Macherey-Nagel) puis dosé grâce au spectrophotomètre Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).

2.3. Extraction de l’ADN génomique, PCR et séquençage

L’extraction de l’ADN génomique des culots cellulaires a été réalisée en utilisant le kit

Nucleospin Tissue (Macherey-Nagel) selon les recommandations du fournisseur. Après

dosage des ADNg au spectromètre Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific), 100 ng ont été utilisés par PCR. A l’ADNg sont ajoutés 12,5 µL de KAPA HiFi HotStart Ready Mix 2X (KAPA

Biosystems) contenant l’enzyme KAPA HiFi (0,5 unité / 25 µL de réaction), les dNTP (0,6 mM), le tampon de réaction et le MgCl2 (5 mM). A cette solution sont additionnés les amorces sens et anti-sens à 10 µM, ainsi que l’H2O MilliQ pour obtenir un volume final de 25 µL. Afin de vérifier le knock-out du gène CD274/PD-L1 par les Zinc finger nucleases, les amorces utilisées sont : 5’-CAGAGCTAGCAGGTGTTCCC-3’ pour le sens et 5’-TGTTGATTCTCAGTGTGCTGG-3’ pour l’anti-sens. Les différentes étapes de la PCR sont : 3 minutes à 95°C, puis 35 cycles comprenant chacun 20 secondes à 98°C, 15 secondes à 64°C et 30 secondes à 72°C ; enfin, 7 minutes à 72°C. Les produits de PCR sont ensuite purifiés grâce au kit Nucleospin Gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel) et séquencés (société

GATC Biotech) à partir de l’amorce 5’-TTAAGCATATCCCTCTG-3’. Les séquences obtenues ont été analysées avec le logiciel ClustalW2 développé par l’EMBL-EBI (European Molecular

Biology Laboratory – European Bioinformatics Institute).

Les régions OFF-target putatives des ZFN ont été vérifiées de la même manière, en utilisant les amorces pour PCR et séquençage détaillées dans en Annexe 3.

2.4. Extraction des ARN, synthèse des ADNc et Q-RT-PCR

2.4.1. Extraction des ARN totaux

Les ARN totaux provenant de lignées cellulaires ou de tumeurs issues de xénogreffes de souris sont purifiés selon le protocole du kit Nucleospin RNA kit (Macherey-Nagel). Ils sont ensuite élués dans 60 µL de tampon d’élution Nucleases-free et dosés par spectrométrie UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).

2.4.2. Synthèse des ADNc

La synthèse des ADNc est réalisée par rétro-transcription à l’aide du kit SuperScript

VILO cDNA Synthesis (Thermo Fisher Scientific). Une réaction se fait à partir de 2,5 µg

d’ARN, auxquels sont ajoutés 4 µL de tampon 5X VILO Reaction Mix, 2 µL d’enzyme 10X

SuperScript Enzyme Mix et le volume réactionnel final est ajusté à 20 µL avec de l’eau DEPC-traitée (diéthyl pyrocarbonate). La réaction de rétro-transcription est réalisée sur thermocycleur Veriti (Applied Biosystems) selon le protocole suivant : 10 minutes à 25°C, 60 minutes à 42°C puis 5 minutes à 85°C. Les échantillons d’ADNc sont conservés à -80°C jusqu’à utilisation pour les réactions de Q-RT-PCR.

2.4.3. Q-RT-PCR

La méthode de quantification par chimie SYBR Green (Applied Biosystems) a été utilisée afin de mesurer les transcrits de différents gènes. L’analyse est effectuée en plaque 96 puits, en triplicat, à l’aide de l’appareil ABI StepOnePlus apparatus (Applied Biosystems). Chaque puits contient 20 ng d’ARN équivalent ADNc, 1 µM de chaque amorce sens et anti-sens (Tableau 10), l’agent SYBR Green Master Mix à une concentration 1X (Applied

Biosystems), complété par un volume d’H2O stérile RNase/DNase free afin d’atteindre un volume final de 20 µL. Les réactions de Q-RT-PCR ont été réalisées en utilisant le protocole standard du logiciel StepOne Software (Applied Biosystems) : 15 minutes à 95°C, suivies par 35 cycles de 15 secondes chacun à 95°C puis une étape de 1 minutes à 60°C et enfin, une étape d’élévation de la température de 60 à 95°C afin de déterminer la courbe de dissociation, permettant d’observer un pic unique confirmant la présence d’un seul ampligène. Le gène de référence utilisé est la GAPDH. Chaque matrice est analysée en triplicat sur chaque plaque avec 1 puits témoin ne contenant pas d’ADNc. Chaque expérience est réalisée au minimum 3 fois. Le Ct (cycle at threshold) obtenu correspond à la valeur de cycles à laquelle le signal de la sonde se détache du bruit de fond. L’expression relative des ARNm est ensuite déterminée selon la méthode ΔΔCT.

Amorces sens (5'-3') Amorces anti-sens (5'-3')

PRX3 TTAAACATGGTTAGTTGCTAGTACAAGGA TTGAGACATGATCTAAGAATAGCCTTCTA

GSTM3 CCTGGATGGGAAGAACAAGA TTGTGTGCGGAAATCCATTA

NQO2 GAAACCCACGAAGCCTACA CAGCACCCTATCCATCCAG

ABCC2 ACAGAGGCTGGTGGCAACC ACCATTACCTTGTCACTGTCCATGA

HIF1a GAAAGCGCAAGTCTTCAAAG TGGGTAGGAGATGGAGATGC

LDHA AGCCCGATTCCGTTACCT CACCAGCAACATTCATTCCA

PDHK1 CGGATCAGAAACCGACACA ACTGAACATTCTGGCTGGTGA

GLUT1 AACTCTTCAGCCAGGGTCCAC CACAGTGAAGATGATGAAGAC

GLUT3 TTCAAGAGCCCATCTATGCC GGTCTCAGGGACTTTGAAGA

GAPDH ACCCACTCCTCCACCTTTGA CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT

Tableau 10: Récapitulatif des primers sens et anti-sens utilisés lors des réactions de