Evaluation phénotypique du rôle de PD-L1 dans les cellules tumorales

La protéine PD-L1 a été démontrée comme ayant un rôle dans la croissance cellulaire. En effet, l’expression de PD-L1 dans des cellules de cholangiocarcinome et des cellules souches de cancer gastrique favorise leur croissance 224,225, alors qu’à l’inverse, elle maintient un phénotype souche dans le cas de cellules cancéreuses de sein 226.

Aussi, et dans l’objectif second de caractériser notre modèle de MDA-MB-231, nous nous sommes intéressés au rôle de PD-L1 au niveau de la croissance cellulaire.

1.1. La protéine PD-L1 module la croissance des cellules MDA-MB-231

Premièrement, nous avons voulu évaluer l’effet de l’isoforme 1 de PD-L1 sur la croissance des cellules cancéreuses de sein MDA-MB-231 in vitro. Pour cela, et à partir des deux lignées générées « VIDE » et « PD-L1 », nous avons réalisé des tests clonogéniques, et évalué la croissance en cultures 2D et 3D, ainsi que lors d’un test de compétition, celui-ci nous permettant de déterminer si l’une des deux lignées a un avantage de croissance par rapport à la seconde.

En Figure 36A, nous pouvons voir les colonies cellulaires formées 10 jours après ensemencement des cellules « VIDE » et « PD-L1 », en condition basale (normoxie) ou hypoxique ; cette dernière afin d’accroître la potentielle différence de croissance pouvant exister entre les deux lignées. La condition hypoxique a été réalisée dans une étuve à hypoxie ou suite à un traitement avec du CoCl2, agent induisant la stabilisation du facteur HIF-1α. S’il n’y a pas de différence observée en normoxie, l’induction d’un état hypoxique favorise la formation de colonies et l’augmentation de leur taille, dans la lignée MDA-MB-231 « VIDE » par rapport à la lignée « PD-L1 ». Ce résultat a été confirmé lors de tests de croissance en culture 3D (Figure 36B). Ce type de culture permet aux cellules de croître ou d’interagir avec leur environnement dans les trois dimensions, et est de ce fait plus représentatif de ce qui se produit réellement in vivo. Ainsi, que ce soit en condition de normoxie, d’hypoxie ou après traitement au CoCl2, les sphéroïdes observés pour la lignée « PD-L1 » sont de taille réduite par rapport à ceux de la lignée « VIDE » (Figure 36B). Ces résultats nous ont conduits à réaliser une cinétique de croissance par comptages sur 6 jours. Celle-ci montre une diminution significative de la croissance cellulaire dans la lignée MDA-MB-231 « PD-L1 » comparée à la

lignée « VIDE », respectivement de 18%, 19% et 27% aux jours 3, 4 et 6 (Figure 36C). Cette différence a été confirmée suite à un test de compétition entre les deux lignées. Pour cela, les cellules « VIDE » et « PD-L1 » ont été ensemencées à un ratio de 1/1 qui a ensuite été évalué par cytométrie en flux pendant 14 jours afin de déterminer un potentiel avantage au profit d’une des deux lignées. Ainsi, après 3 jours de culture, les cellules « PD-L1 » représentent 39% de la population totale, contre 61% pour les « VIDE ». Cette proportion se révèle relativement stable dans la durée, puisque après 14 jours de culture, 42% des cellules sont de la lignée « PD-L1 » et 58% des « VIDE » (Figure 36D). Pour résumer, la protéine PD-L1 confère un désavantage de croissance in vitro dans notre modèle cellulaire MDA-MB-231.

Figure 36 : L’expression de PD-L1 module la croissance des cellules MDA-MB-231. A)

Test clonogénique des cellules MDA-MB-231 ± PD-L1, ensemencées à 200 cellules / puits en plaque 6 puits, puis cultivées en condition basale (normoxie), en étuve à hypoxie ou avec 200 µM de CoCl2, agent mimant les conditions hypoxiques. Après 10 jours, les cellules sont fixées au PAF et marquées au crystal violet. L’expérience présentée est représentative d’au minimum 3 réalisées. B) Ces cellules sont cultivées en 3D (Matériel et Méthodes, chapitre

4.1.3.) et dans les mêmes conditions qu’en A) pendant 10 jours. Les images de microscopie présentées sont représentatives des deux expériences. C) Cinétique de croissance des cellules MDA-MB-231 ± PD-L1, ensemencées au jour 0 à raison de 50 000 cellules par boite de pétri 100 mm et comptées après 3, 4 et 6 jours. Les barres représentent le pourcentage relatif de cellules « PD-L1 » / « VIDE » à un temps donné ± l’écart-type (n = 6 ; test de Student ; **p<0,01). D) Test de compétition entre les cellules « VIDE » et « PD-L1 ». Après avoir été ensemencées à un ratio 1/1, l’évolution de celui-ci a été analysée en cytométrie en

La croissance est le résultat d’une balance entre capacités prolifératives et mort cellulaire. Nous avons donc étudié l’influence de la protéine PD-L1 sur la mort cellulaire et les propriétés prolifératives de nos modèles cellulaires MDA-MB-231 « VIDE » et « PD-L1 ». Ainsi, l’expression de l’isoforme 1 de PD-L1 provoque une diminution de 6%, faible mais significative, de la survie des cellules MDA-MB-231 par rapport aux cellules « VIDE » après 24 heures de culture (Figure 37A). PD-L1 accroît donc le taux d’apoptose basal de cette lignée. Les propriétés prolifératives de ces cellules ont ensuite été evaluées en analysant le cycle cellulaire par incorporation d’Iodure de Propidium. Nous n’observons aucune différence entre les pourcentages de cellules « VIDE » et « PD-L1 » en phases G1 (environ 50%), S (environ 15%) et G2/M (environ 35%) (Figure 37B). Une expérience similaire réalisée sur les cellules cultivées en condition mimant un état hypoxique avec du CoCl2 n’a pas permis de déceler une éventuelle différence de cycle cellulaire entre ces deux lignées MDA-MB-231 « VIDE » et « PD-L1 » (données non montrées).

La différence de croissance observée in vitro serait donc due à une augmentation du taux basal de mortalité pour les cellules exprimant PD-L1, sans impact au niveau des capacités prolifératives de ces cellules par rapport aux contrôles « VIDE ».

Figure 37 : Survie et prolifération des cellules MDA-MB-231 « VIDE » et « PD-L1 » in vitro. A) Le taux basal de mortalité des lignées « VIDE » et « PD-L1 » a été analysé par un

test Annexine V/IP. Les cellules non marquées AV-/IP- sont considérées vivantes, AV+/IP- en apoptose précoce et les AV+/IP+ en apoptose tardive (n = 5 ± l’écart-type ; test de Student, **p<0,01). B) Le cycle cellulaire des cellules MDA-MB-231 « VIDE » et « PD-L1 » a été analysé en cytométrie en flux après incorporation d’Iodure de Propidium (n = 3 ± l’écart-type). n.s, non significatif.

1.2. PD-L1 favorise la progression tumorale in vivo

Les résultats précédents démontrent une diminution de la croissance cellulaire induite

in vitro par l’expression de l’isoforme 1 de PD-L1. Nous avons donc poursuivi en étudiant, deuxièmement, l’impact que peut avoir cette protéine sur la croissance tumorale in vivo. Pour

cela, nous avons réalisé des xénogreffres de cellules MDA-MB-231 « VIDE » et « PD-L1 » dans un modèle murin immuno-déficient Nude, en injectant les cellules en sous-cutané. En Figure 38A, les souris injectées avec les cellules « PD-L1 » présentent, 80 jours après injection, une élévation significative de 46% de la croissance tumorale par rapport aux tumeurs issues des cellules « VIDE ». Il est intéressant de noter que l’augmentation de la taille des tumeurs due à l’expression de PD-L1 semble résulter d’une prise de greffe plus rapide de ces cellules par rapport aux « VIDE ». Ces résultats démontrent par ailleurs la capacité de cette protéine à engendrer une agressivité tumorale accrue malgré l’absence de lymphocytes T, cellules dans lesquelles son récepteur PD-1 est fortement exprimé. L’augmentation de la croissance tumorale par « PD-L1 » a également été observée dans deux autres expériences indépendantes (Figure 38B).

Figure 38 : L’expression de PD-L1 favorise la croissance tumorale in vivo. A) 106 cellules MDA-MB-231 “VIDE” ou “PD-L1” ont été injectées en sous-cutané au niveau du flanc droit de souris femelles athymiques Nude de 8 semaines (n = 8 souris / groupe). Le volume tumoral a ensuite été mesuré avec un caliper pendant 6 semaines (moyenne ± SEM). La moyenne des volumes tumoraux produits par les cellules « PD-L1 » est significativement plus élevée que pour les cellules « VIDE » (* p<0,05). B) Deux autres expériences identiques à celle décrite en

Pour aller plus loin, nous avons voulu déterminer les voies de signalisation modulées par l’expression de PD-L1. Pour cela, nous nous sommes intéressés à l’étude du kinome ou « phosphorylation antibody-array », réalisée par la société Full Moon BioSystems (Sunnyvale, CA), ainsi qu’au transcriptome par puce Affymetrix et dont l’analyse a été effectuée par la plateforme de Génomique de Lille 2.