SURFACE MICROMACHINING USING PLASMA ETCHING

4.1. Reagentes

4.1.1. Padrões de triacilgliceróis 4.1.2. Padrões de fitosteróis

4.1.3. Padrões de tocoferóis e tocotrienóis 4.1.4. Padrões internos

4.1.5. Regentes de derivatização usados na determinação dos fitosteróis 4.1.6. Adsorventes

4.1.7. Solventes e reagentes 4.1.8. Gases

4.2. Equipamento

4.2.2. Cromatógrafos líquidos 4.2.3. Outros equipamentos 4.2.4. Consumíveis

4.1. Reagentes

4.1.1. Padrões de triacilgliceróis

O 1,2,3-triaraquidoilglicerol (AAA), o 1,2,3-trimiristoilglicerol (MMM), o 1,2,3-tripalmitoilglicerol (PPP), o 1,2,3-triestearoilglicerol (SSS), o 1,2,3-trilinolenoilglicerol (LnLnLn) e o 1,2,3-tripalmitoleoilglicerol (PoPoPo) todos com pureza ≥ 98,0%; e ainda o 1,2,3-trioleoilglicerol (OOO), o 1,2,3-trilinoleoilglicerol (LLL), o rac-1,2-dilinoleoil-3-palmitoilglicerol (LLP), o rac-1,2-dilinoleoil-3-oleoilglicerol (LLO), o rac-1,2-dipalmitoil-3-oleoilglicerol (PPO), o rac-1,2-dioleoil-3-estearoilglicerol (OOS), o 1-palmitoil-2-oleoil-3-linoleoilglicerol (POL) e o rac-1,2-dioleoil-3- palmitoilglicerol (OOP) todos “com aproximadamente 99,0%” de pureza, foram fornecidos pela Sigma (St. Louis, MO, Estados Unidos).

O material de referência “ Triglyceride olive Standard Mix”, com 60% de 1,2,3-trioleoilglicerol (OOO), 30% de rac-1,2-dioleoil-3-palmitoilglicerol (OOP), 4% de

rac-1,2-dioleoil-3-estearoilglicerol (OOS) e de rac-1,2-dilinoleoil-3-oleoilglicerol (LLO) e 2% de 1,2,3-trilinoleoilglicerol (LLL), foi adquirido à Supelco (Bellefonte, PA, Estados Unidos).

De cada substância, prepararam-se soluções a 5 g/l em acetona, que foram conservadas a 4 °C, em frascos de vidro castanho de 4 ml, com tampas de plástico revestidas internamente com Teflon® PTFE (Politetrafluoroetileno), fornecidos pela Supelco. As soluções diluídas, com a concentração adequada, foram preparadas no momento da análise.

4.1.2. Padrões de fitosteróis

Os padrões de campesterol, β-sitostanol, β-sitosterol, estigmasterol, colesterol e palmitato de colesterol, todos com pureza ≥ 96,0% foram fornecidos pela Sigma.

De cada substância, prepararam-se soluções a 2,5 g/l em n-hexano:éter de petróleo (80:20 v/v), que foram conservadas a 4 °C, em frascos de vidro castanho de 4 ml, com tampas de plástico revestidas internamente com Teflon® PTFE (Supelco). As soluções diluídas, com a concentração adequada, foram preparadas no momento da análise.

4.1.3. Padrões de tocoferóis e tocotrienóis

Os padrões de α-tocoferol, β-tocoferol, γ-tocoferol, δ-tocoferol, α-tocotrienol,

β-tocotrienol, γ-tocotrienol e δ-tocotrienol, todos com pureza ≥ 95,0% foram fornecidos pela Calbiochem (La Jolla, CA, Estados Unidos).

De cada substância, prepararam-se soluções a 5 g/l em n-hexano, que foram conservadas a -20 °C, em frascos de vidro castanho de 4 ml, com tampas de plástico revestidas internamente com Teflon® PTFE (Supelco) e fechados sob corrente de azoto. As soluções diluídas, com a concentração adequada, foram preparadas no momento da análise, tendo sido sempre realizada em câmara escura.

4.1.4. Padrões internos

Os padrões internos, colestanol e betulina, para determinação dos fitosteróis, ambos com pureza ≥ 98,0%, foram adquiridos à Sigma. O 2-metil-2-(4,8,12- trimetiltridecil)-croman-6-ol (tocol) para determinação dos tocoferóis e tocotrienóis, com pureza ≥ 95,0%, foi fornecido pela Matreya (Pleasant Gap, PA, Estados Unidos).

As soluções dos padrões internos foram preparadas com as concentrações adequadas no momento de utilização.

4.1.5. Reagentes de derivatização usados na determinação dos fitosteróis

Os reagentes de derivatização, N-metil-N-(trimetilsilil)-heptafluorobutiramida (MSHFBA), N-(terc-butildimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) com 1% de trimetilclorosilano (TMCS), N,O-bis-trimetilsililtrifluoroacetamida (BSTFA) com 1% de TMCS e etér terc-butilmetílico, todos com pureza ≥ 99,0%, foram fornecidos pela Sigma.

Os reagentes usados no processo de transesterificação dos ácidos gordos, as soluções metanólicas de trifluoreto de boro a 14% em metanol e de metóxido de sódio a 30% em metanol, ambos com pureza ≥ 97%, foram fornecidos pela Sigma e Fluka, respectivamente.

A piridina e o 1-metilimidazol usados como catalizadores, ambos com pureza

≥ 99,0% foram fornecidos pela Fluka (Neu-Ulm, Alemanha) e Sigma, respectivamente. Todos os reagentes foram conservados a 4 °C até ao momento da sua utilização.

As reacções de derivatização foram realizadas em frascos de vidro silanizado de 4 ml com tampas de plástico revestidas internamente com Teflon® PTFE (Supelco).

4.1.6. Adsorventes

O gel de sílica (70-230 “mesh”) e a alumina (60-325 “mesh”) foram fornecidos pela Supelco (Bellefonte, PA, USA). As placas de sílica e o óxido de alumínio 90 padronizado foram fornecidos pela Merck (Darmstad, Alemanha).

4.1.7. Solventes e reagentes

O hidróxido de potássio e o cloreto de sódio, ambos com pureza p.a. (para análise) foram adquiridos à Panreac (Barcelona, Espanha).

A trioleína [1,2,3-tri-cis-9-octadecenoilglicerol], com pureza de 65%, foi fornecida pela Sigma.

O ácido cítrico, com pureza de 98%, foi fornecido pela Aldrich (St. Louis, MO, USA).

O sulfato de sódio anidro, com pureza p.a., foi adquirido à Merck, tendo sido tratado por aquecimento durante 5 h em mufla a 500 °C.

A acetona, o acetonitrilo e o n-hexano foram adquiridos à Merck, e o 1,4-dioxano foi adquirido à Fluka, todos com pureza LiChrosolv, foram usados como eluentes em cromatografia líquida de alta eficiência.

Os restantes solventes orgânicos usados, nomeadamente o metanol, o n-heptano, o etanol, o éter de petróleo (40-60 °C) e o éter dietílico, todos com pureza p.a., foram adquiridos à Merck ou à Fluka.

4.1.8. Gases

Como gás de arraste nos sistemas de cromatografia gasosa usou-se Hélio com pureza de 99,9999%. Como gases auxiliares no aparelho de cromatografia gasosa com detector FID usaram-se o azoto, o hidrogénio e o ar todos com pureza de 99,9995%. Para evaporação dos solventes usou-se azoto com pureza de 99,9995%. Todos os gases foram fornecidos pela Air-Liquide (Maia, Portugal).

4.2. Equipamento

4.2.1. Cromatógrafos gasosos

Na determinação dos ácidos gordos usou-se um cromatógrafo da Chrompack (Palo Alto, CA, Estados Unidos), modelo CP 9001, equipado com um injector do tipo

“split-splitless”, associado a um detector de ionização em chama FID e provido de um sistema automático de injecção da Chrompack modelo CP 9050. O sistema de controlo, aquisição e tratamento de dados foi fornecido pela CP-Maitre Chromatography Data System, Version 2.5 (Chromopack Internacional B.V., França).

Na determinação dos fitosteróis usou-se o mesmo equipamento descrito para os ácidos gordos e um aparelho de GC-MS da marca Hewlett-Packard (Agilent, Little Falls, DE, Estados Unidos), modelo HP GC-6890, equipado com um injector “split- splitless” e associado a um detector selectivo de massa, modelo Agilent MSD-5973N. O sistema de controlo, aquisição e tratamento de dados foi fornecido pela HP modelo- Agilent MS Chemstation G2578A software.

4.2.2. Cromatógrafos líquidos

Na determinação dos tocoferóis, tocotrienóis e triacilgliceróis usaram-se dois aparelhos de cromatografia líquida de alta eficiência ambos da marca Jasco (Jasco, Japão) e equipados com bombas modelo PU-980 e sistema automático de injecção, modelo AS-950, provido de injector Reodyne Modelo 9125 com um “loop” de 10 µl.

Um dos cromatógrafos estava equipado com um detector de fluorescência modelo FP-920 ligado em série a um detector de díodos modelo MD-910 ambos da marca Jasco. O outro cromatógrafo estava equipado com um detector evaporativo de dispersão de luz [“Evaporative Light Scattering” (ELSD)] modelo 75 da marca Sedere (Sedere, França). Em ambos os equipamentos o sistema de controlo, aquisição e tratamento de dados foi fornecido pela Borwin-PDA Controller Software (JMBS, França).

4.2.3. Outros equipamentos

As homogeneizações das amostras foram efectuadas num homogeneizador da marca Janke Kunkel-IKA Labortechnik (Staufen, Alemanha), modelo Ultra-Turrax T25.

As centrifugações foram efectuadas numa centrífuga da marca Heraeus Sepatek (Osterode, Alemanha), modelo Labofuge A.

As reacções de derivatização foram efectuadas num bloco de aquecimento, da marca Pierce (Rockford, IL, Estados Unidos), modelo Reacti-Therm 187900, provido com corrente de azoto para evaporação de solventes.

A evaporação de solventes sem corrente de azoto foi efectuada num evaporador rotativo da marca Büchi, modelo RE 111, equipado com um banho de água modelo 461 (Flawil, Suiça).

A agitação mecânica dos frascos e tubos foi efectuada num agitador do tipo vortex, da marca Vortex VWR- Internacional (Merck, West Chester, PA, Estados Unidos).

Para as eluições das colunas de extracção em fase sólida foi usada uma câmara com controlo de vácuo fornecido pela Supelco, modelo Visiprep Solid Phase Extraction Manifold, com capacidade para 12 colunas.

Todas as pesagens foram efectuadas numa balança de precisão Mettler Toledo (Greifensee, Suíça), modelo AG 204 com definição até cinco casas decimais e numa balança analítica da marca Sartorius (Goettingen, Alemanha).

O aquecimento das colunas de HPLC foi efectuada num forno de colunas fornecido pela Jones Chromatography (Hengoed, Mid-glamorgan, Reino Unido), modelo 7981 com controlo automático de temperatura e intervalo de temperatura entre os 20°C e 70 °C.

A secagem de alguns adsorventes e de tubos de vidro foi efectuada numa mufla da marca Thermolyne (Barnstead International, Dubuque, IA, Estados Unidos), modelo Furnace 4800 e numa estufa da marca WTB Binder (Namdong, Ku, Coreia do Sul).

Para a limpeza das seringas de cromatografia gasosa (no final de cada injecção) usou-se um sistema de aquecimento por resistência eléctrica com funcionamento a pressão reduzida da marca Hamilton Company (Reno, NV, Estados Unidos).

4.2.4. Consumíveis

Os “liners”, “septos” e outros consumíveis usados no injector dos cromatógrafos gasosos foram adquiridos às respectivas marcas da aparelhagem: Chrompack e Agilent.

Para a filtração dos extractos usaram-se filtros descartáveis de 0,22 µm de PTFE da marca Teknokroma (Barcelona, Espanha).

Para injecção nos cromatógrafos gasosos usaram-se seringas da marca Hamilton Bonaduz AG (Bonaduz, Suiça) de 10 µl de volume total, com uma agulha de 7 cm de comprimento e ponta em forma de bisel. Foram também usadas seringas da mesma marca de 50 µl de volume total, com uma agulha de 10 cm de comprimento para injecção nos cromatógrafos líquidos.

CAPÍTULO 5