Stratégie d‘immobilisation

Les immunorécepteurs ont une taille, au minimum, d‘un ordre de grandeur supérieur aux molécules utilisées dans les SAMs. Les anticorps, utilisés comme récepteurs biologiques dans notre cas, ont une taille évaluée à 10-20nm118, tandis que les molécules utilisées pour la SAε ont une longueur de l‘ordre de 1 à γ nm119_{. Ainsi un anticorps peut recouvrir} jusqu‘à β0 thiols. Cela signifie que la majorité des thiols présents en surface ne formeront pas de liaison covalente avec le récepteur bien que plusieurs thiols peuvent réaliser une liaison avec différents groupements amine de l‘anticorps. Dans le but de faciliter l‘immobilisation des récepteurs, de favoriser leur mobilité relative, d‘améliorer la stabilité, la reproductibilité, et d‘éviter les absorptions non-spécifiques sur la surface120–124_{, il est} proposé d‘utiliser une architecture dite « mixte ». Les architectures mixtes offrent beaucoup d‘avantages pour des applications d‘immunocapture. Il existe de nombreuses

possibilités où les critères tels que la distribution, l‘accessibilité ou la fonctionnalité peuvent être définis par le choix des molécules employées dans la SAM. Certaines études sur la formation de SAMs mixtes sur substrat or ont révélé une augmentation par rapport à une SAε monomoléculaire, du nombre d‘anticorps greffés sur ces surfaces123,124_. Généralement ces architectures sont composées de molécules « linker » permettant d‘immobiliser les récepteurs, diluées avec d‘autres molécules appelées « spacer » qui vont prévenir les adsorptions non-spécifiques sur la surface120,124,125. δ‘alkanethiol utilisé comme « spacer » permet d‘éviter l‘encombrement stérique lié à l‘immobilisation des anticorps. En effet, l‘utilisation de « linker » dotés de chaînes plus longues que les « spacer » va permettre, dans le cas idéal, de rendre plus accessible les groupes de tête nécessaires à l‘immobilisation des bio-récepteurs. δ‘utilisation d‘un couple « spacer » / « linker » optimal est déterminé pour offrir le plus de degrés de liberté aux « linker » tout en évitant leur repliement. Cela aura pour conséquence de greffer une plus forte densité d‘anticorps sur ce type d‘architecture que sur des SAεs homogènes126_{. Ce type d‘effet a} été étudié au sein de notre équipe de recherche notamment pour la fonctionnalisation des substrats de GaAs destinés à l‘immobilisation de couche protéique127,128_{. Les architectures} mixtes étudiées sur or129,130, ont mis en évidence la dépendance des propriétés de tension de surface en fonction de la longueur de chaîne alkyle, du groupe fonctionnel et du ratio entre les thiols utilisés. Dans une monocouche bi-structurée, on peut obtenir aussi bien des conformations simples avec une distribution et répartition homogène des molécules que plus complexes par la formation d‘ilots de taille micro- ou nanométrique129_{. La plupart du} temps les monocouches mixtes sont élaborées à partir du mélange en solution des composés d‘intérêts. δa composition de la SAε ne va pas forcément refléter le rapport de concentration des molécules en solution130. Une fois mélangées, les molécules peuvent avoir un comportement différent lors de leur auto-organisation sur la surface. D‘où l‘intérêt de caractériser les SAε mixtes afin d‘établir une corrélation entre les pourcentages de thiols en solution et leur pourcentage sur la SAM constituée.

Différentes architectures seront étudiées dans ces travaux. δ‘approche de fonctionnalisation la plus utilisée est composée des deux alkanethiols suivants (Figure 1.15a) :

 δ‘acide 1θ-mercapto-1-hexadecanoique (ou εHDAΨ constitué d‘une chaîne de 16 carbones et d‘un groupe terminal carboxyle. Sa formule linéaire est : HS-(CH2)15- COOH.

 Le 11-mercapto-1-undecanol (ou εUDηΨ constitué d‘une chaîne de 11 carbones et d‘un groupe terminal hydroxyle. Sa formule linéaire est : HS-(CH2)11-OH.

δ‘acide carboxylique est utilisé pour assurer un lien covalent avec l‘anticorps (liaison amide), tandis que les thiols à terminaison hydroxyle permettent de passiver le substrat et d‘espacer les εHDA. δa liaison covalente avec l‘acide carboxylique est réalisée avec un des groupements amines de la protéine après une procédure dite d‘activation du CηηH. δa différence de longueur de chaîne (15 méthylènes pour le MHDA et 11 pour le MUDO) permet de faciliter les interactions avec les protéines. Frederix et al. ont montré qu‘une architecture mixte constituée de 95% de MUDO et 5% de MHDA donne une meilleure couverture d‘anticorps124 _{qu‘avec des SAεs de εHDA pur. θar comparaison avec} d‘autres groupes terminaux (CH3, COOH, NH2, PheOH), il a été montré également que les thiols à terminaison hydroxyle limitent beaucoup plus les interactions non-spécifiques131_{. Il} aurait été possible avec une architecture composée uniquement de molécules de MHDA, d‘effectuer une étape de blocage des sites actifs par des protéines (BSA, par exempleΨ après immobilisation des anticorps. Cette stratégie permet d‘éviter effectivement la non- spécificité pendant un certain temps mais n‘est pas viable à long terme à cause de la dénaturation des protéines bloquantes au cours du temps132.

La seconde architecture (Figure 1.15b) est constituée à nouveau de MHDA mais cette fois- ci combiné avec l‘alkanethiol suivant :

 Le 1-dodecanethiol (ou DDTΨ constitué d‘une chaîne de 12 carbones et d‘un groupe terminal méthyle. Sa formule linéaire est : HS-(CH2)11-CH3

Figure 1.15: Architecture de SAM constituée de (a) MHDA/MUDO, (b) MHDA/DDT et (c) thiols PEG-biotin

Plus en marge, quelques études seront également effectuées sur l‘architecture homogène (Figure 1.15cΨ dotée de l‘alkanethiol suivant :

 Thiol polyéthylène glycol biotinylé (ou PEG-biotinΨ constitué d‘une chaîne alkyle de 11 carbones, d‘une chaîne de 3 éthylènes glycols et du groupe terminal biotine. Sa formule est HS-(CH2)11-EG3-Biotin.

Cette dernière utilise une autre stratégie d‘immobilisation des anticorps et nécessite l‘utilisation d‘une protéine intermédiaire (Avidin, ζeutrAvidin ou StreptAvidin) et d‘anticorps conjugués avec de la biotine. δ‘avidine revêt une propriété de contrôle de l‘orientation de l‘anticorps contrairement aux autres techniques. Les interactions NeutrAvidin et biotine sont très fortes (même si non-covalentes) et très spécifiques rendant cette fonctionnalisation intéressante pour la réalisation de biointerfaces robustes133,134_{. Le} prix élevé de ces composés, face aux précédentes stratégies, reste toutefois le principal facteur limitant pour cette approche. De façon à conserver la même gamme de prix entre chaque fonctionnalisation, nous réduirons la concentration des molécules utilisées pour former cette architecture.