Contexte général

La plupart des infections bactériennes sont liées à la présence de bactéries dans les eaux de consommation, dans la nourriture ou dans les systèmes de refroidissement ou d‘aération qui leur offrent des conditions favorables à leur développement (température, présence de nutriments…Ψ. δa présence de ces micro-organismes peut engendrer un risque à court terme pour le consommateur ou l‘utilisateur des sytèmes dans lesquels ils se développent. La plupart du temps, les infections qui en résultent sont bénines (troubles gastro-intestinaux, diarrhées,…Ψ comme celles occasionnées par certaines souches communes d‘Escherichia coli (E. coli) mais d‘autres souches peuvent s‘avérer graves. De façon à prévenir ces infections, il est nécessaire de pouvoir détecter et identifier suffisamment tôt la présence des pathogènes dans les milieux à risques. δ‘industrie agro- alimentaire est le principal secteur concerné par la détection de bactéries suivi des environnements cliniques et des eaux de consommation ou eaux industrielles (Figure 1.1). Les analyses effectuées portent essentiellement sur la détection des bactéries telles que les salmonelles, l‘Escherichia coli, les Listeria, les Campylobacter et les légionelles (Figure 1.1).

Figure 1.1 : (a) Secteurs d’intérêt pour la détection de pathogènes et (b) organismes pathogènes les plus couramment détectés par les techniques d’analyses actuelles. Adapté de

Les organismes de surveillance, publics ou privés, emploient essentiellement des techniques de détection de pathogènes dites « conventionnelles » telles que la méthode de culture (comptage et analyse biochimique), les techniques de réaction en chaîne par polymérase (« Polymerase chain reaction », ou PCR) et méthodes immuno-enzymatiques (« enzyme-linked immunosorbent assay » ou ELISA). La méthode la plus répandue pour la détection de pathogènes (bactériens) est celle du comptage de colonies après culture cellulaire. Elle reste la plus précise et la plus robuste dans la détection de ces organismes et de leur quantification. Elle permet également d‘y réaliser une analyse biochimique des organismes cultivés. Cependant cette technique nécessite beaucoup de temps, et un temps relativement variable selon le type ou la souche de bactérie à détecter. En général, le temps requis pour obtenir des résultats préliminaires est de β à γ jours, mais peut aller jusqu‘à 7 à 10 jours pour les confirmer4. A titre d‘exemple, Artault et al. indiquent que le temps requis pour obtenir des colonies visibles avec des bactéries de Listeria monocytogenes est de 7 jours5.

Les techniques PCR combinées aux systèmes de détection ont, depuis une trentaine d‘années, permis la détection de pathogènes via leur séquence ADN. Une cible ADN peut être amplifiée jusqu‘à près de dix milliard de fois sur une gamme de 1h à 24h (en tenant compte du processus d‘extraction de l‘ADζΨ, et avec des sensibilités, en théorie, en dessous d‘une cellule. On trouve diverses techniques associées telles que la PCR temps- réel (« real-time PCR »), la PCR multiplexe (« multiplex PCR »), LAMP (« loop-mediated isothermal amplification »), NASBA (« nucleic acid sequence-based amplification ») ainsi que les techniques combinées avec l‘EδISA, l‘immunofluorescence ou l‘électrophorèse. La PCR prend généralement de 5h à 24h pour produire un résultat de détection mais cela dépend fortement de la méthode utilisée. La PCR offre de meilleures spécificités, sensibilités, précisions et rapidités de détection pour l‘analyse de petites quantités de pathogènes que les autres méthodes conventionnelles.

δa détection immunologique n‘est pas plus sensible et spécifique que les techniques θCR mais est généralement un peu plus rapide, plus robuste et a le potentiel de détecter également les biotoxines libérées par les organismes pathogènes. Cette catégorie regroupe les techniques ELISA (« enzyme-linked immunosorbent assay »), ELFA (« enzyme-linked fluorescent assay »), BEIA (« bioluminescent enzyme immunoassay »), LFIA (« lateral flow immunoassay ») ou encore IMS (« immunomagnetic separation »). Malgré leurs

bonnes performances et leur coût réduit, ces techniques souffrent du manque d‘analyse en temps réel.

Ces trois catégories de méthode de détection sont couramment utilisées dans l‘industrie et dans les laboratoires mais sont souvent considérées comme chronophages. Les domaines de l‘industrie agro-alimentaire, du traitement des eaux, du diagnostic clinique dans lesquels ces techniques sont utilisées, sont demandeurs de nouvelles technologies plus rapides, fiables, spécifiques, sensibles et simples à mettre en place tout en conservant des coûts de vente et d‘utilisation faibles. δa possibilité de réaliser les analyses en temps réel est également une caractéristique clé pour ces détections. Ces dernières années ont vu le développement des activités de recherche dans le domaine des biocapteurs pour la détection des micro-organismes pathogènes. Ces biocapteurs pourraient ainsi accélérer les temps d‘analyse tout en offrant une détection similaire aux techniques conventionnelles en terme de sensibilité. De plus, les biocapteurs offrent la possibilité de réaliser des dispositifs compacts pouvant permettre l‘intégration ou le déplacement des systèmes sur site si nécessaire. Par exemple, le domaine médical cherche des solutions pour réaliser le diagnostic dans les cliniques voire au chevet des malades plutôt que dans un laboratoire. Il est également question pour ce type de technique d‘avoir une plus grande simplicité de prise en main et mise en œuvre. Comme nous le verrons par la suite, les biocapteurs sont souvent classés par type de transduction (optique, électrochimique, piezoélectrique…Ψ auquel est combinée une interface de reconnaissance biologique. La Figure 1.2 représente, en fonction de leur limite de détection et de leur temps d‘analyse, de nombreuses références regroupées par catégories de détections (culture, tests immunologiques, PCR, biocapteur optique, biocapteur électrochimique et biocapteur sensible à l‘ajout de masse). On remarque, comme indiqué précédemment, que les techniques conventionnelles demandent des temps d‘analyse plus longs que les trois catégories de biocapteurs. δes biocapteurs n‘atteignent pas encore l‘état de l‘art des limites de détection des méthodes conventionnelles mais nous pensons que les progrès dans ce domaine vont permettre dans un avenir proche de dépasser cette limite. En effet, ils ont encore du chemin à faire pour la spécificité afin d‘éviter l‘obtention de faux positifs.

C‘est dans cette optique que nous proposons dans les travaux présentés ici, l‘élaboration et l‘étude d‘un biocapteur à ondes acoustiques de volume. θar l‘utilisation de l‘arséniure de gallium comme matériau piézoélectrique, nous avons l‘ambition de fabriquer un dispositif

permettant d‘atteindre de meilleures performances que les microbalances à quartz (QCεΨ existantes. En conservant la gamme de durée moyenne d‘analyse d‘un QCε (γ0min à 4hΨ, ses capacités de miniaturisation et en augmentant sa sensibilité (et spécificité), on obtiendrait ainsi un capteur idéal pour l‘analyse et la détection de pathogènes sur site.

Figure 1.2 : Limite de détection (CFU/mL) versus durée d’analyse (h) pour différentes techniques de détection de pathogènes. L’ensemble des références utilisées dans ce graphique a été répertorié dans le tableau de l’annexe A. Les groupements correspondent aux catégories de détection : biocapteurs électrochimiques (noir), biocapteurs sensibles aux variations de

masse ou à des paramètres mécaniques (rouge), biocapteurs optiques (bleu), tests immunologiques (violet), techniques de détection d’acides nucléiques (vert) et culture

(orange)