Stimulation de l’activité phosphatase de SHP1 par un analogue de la somatostatine :

La protéine tyrosine phosphatase SHP1 peut être considérée comme une cible thérapeutique de choix de part son rôle de régulateur négatif du pouvoir oncogénique de NPM-ALK. Il semble donc intéressant de potentialiser son action en augmentant son activité. Ainsi, nous avons recherché des moyens permettant de stimuler l’activité phosphatase de SHP1.

Comme cela a été abordé dans les rappels bibliographiques, de nombreux travaux montrent que le traitement des cellules tumorales avec des analogues de la somatostatine entraîne une diminution significative de leur prolifération via l’activation de SHP1. La somatostatine exerce son activité antiproliférative à travers des récepteurs à 7 segments transmembranaires spécifiques couplés aux protéines G. Cinq sous-types de récepteurs à la somatostatine (SSTR1-SSTR5) ont été identifiés chez l’Homme. Le récepteur SSTR2 a été décrit comme médiant l’activité antiproliférative de la somatostatine via une activation de SHP196, 99, 103, 104. De plus, les analogues de la somatostatine radiomarqués sont utilisés en clinique pour détecter par scintigraphie les lésions lymphomateuses de patients atteints de lymphomes non Hodgkiniens423, 424. En effet, 70 à 100% des lymphomes non Hodgkiniens prélevés par chirurgie, expriment les récepteurs SSTR2 et SSTR5. L’expression du récepteur SSTR2 a également été montrée dans les lymphocytes activés et semble corréler avec la transformation néoplasique de ces derniers425. Cela indique un possible ciblage des cellules lymphoïdes malignes de LAGC ALKpositifs. La courte durée de vie de la somatostatine a conduit au développement d’analogues peptidiques de synthèse, dont la stabilité et le potentiel anti-tumoral sont augmentés. Certains de ces analogues, tels que l’octréotide ou le lanréotide, sont déjà utilisés en clinique pour leur capacité à réduire des tumeurs neuroendocrines426. A partir des données de la littérature, nous avons émis l’hypothèse qu’une stimulation de cellules NPM-ALK et SHP1 positives avec l’analogue de la somatostatine vapreotide (RC- 160) pourrait conduire à une diminution de la prolifération cellulaire et/ou à une augmentation de l’apoptose. Le RC-160 est un petit peptide synthétique présentant une forte affinité pour SSTR2 et ayant une demi-vie plus grande que l’hormone elle-même.

96 Au cours de ces travaux, nous avons recherché dans un premier temps l’expression du récepteur SSTR2 dans les lignées de LAGC disponibles au laboratoire. Puis nous avons testé l’effet du RC-160 sur l’activation de SHP1 dans deux lignées NPM-ALK positives Karpas 299 et Cost. Ayant préalablement montré que NPM-ALK est un substrat de SHP1, nous avons étudié son niveau de phosphorylation sur tyrosine, ainsi que celui d’un de ses principaux effecteurs : STAT3, sous l’effet du traitement des cellules avec le RC-160. Afin de tester l’impact du RC-160 sur le pouvoir oncogènique de NPM-ALK, nous avons mesuré la viabilité des lignées cellulaires NPM-ALK positives traitées par des doses croissantes de RC-160. Enfin, des expérimentations préliminaires in vivo menées sur des souris xénogreffées avec une lignée de LAGC NPM-ALK positive et traitées quotidiennement avec du RC-160, nous ont permis d’apprécier l’effet de l’analogue de la somatostatine sur la croissance tumorale.

Matériel et méthodes :

Réactifs, anticorps et culture cellulaire :

Les lignées cellulaires de LAGC Karpas 299, SU-DHL1 et FEPD, proviennent de l’ATCC (American Type Culture Collection). Les lignées cellulaires Cost et Pio ont été développées au sein du laboratoire à partir de patients atteints de LAGC NPM-ALK positifs. Les cellules sont maintenues en culture à 37°C sous une atmosphère humide à 5% CO2. Le milieu de

culture est l’IMDM (Iscove Modified Dulbecco Medium) supplémentéen 15% SVF (Sérum de Veau Fœtal), L-glutamine (L-Glu) 2mM, pénicilline (P) 100 U/mL,streptomycine (S) 100 µg/mL et en pyruvate de sodium (PyNa) 1mM. Le RC-160, un octapeptide synthétique analogue de la somatostatine (D-Phe, Cys, Tyr, D-Trp, Lys, Val, Cys, Trp-NH2), est fourni

par American Peptide. L’anticorps dirigé contre le récepteur SST2R est un don du Dr Susini (Inserm U531). L’anticorps anti-ALK (ALK1) est fourni par Dako, le anti-SHP1 par Santa Cruz, le anti-STAT3 et phosphoSTAT3 par Cell signaling et le anti-phosphotyrosine 4G10 par Upstate.

Stimulation des cellules au RC-160 et préparation des lysats cellulaires :

Les cellules en suspension (107) dans 10mL le milieu de stimulation (IMDM + PyNa + L-Glu + PS) sont traitées avec le RC-160 à 37°C pendant le temps souhaité. Le milieu de stimulation n’est pas supplémenté en SVF afin de diminuer les risques d’interactions non spécifiques venant des facteurs de croissance contenus dans le SVF. A la fin de la stimulation, les cellules sont immédiatement placées à 4°C pour stopper la réaction, centrifugés à 4°C à 1000 rpm

97 pendant 7 minutes, puis lysés dans 700µl de tampon RIPA 1X (pH 7.4, Tris Base 20mM, NaCl 150mM, EDTA 4mM, Triton X100 0,5 %, 1mM de sodium orthovanadate (OV), 1 mM de PMSF (phénylméthylsulfonylfluoride), mélange d’anti-protéases à 10 µg/mL). Les lysats sont ensuite soniqués 3 fois 10 secondes, puis centrifugés à 13000 rpm pendant 10 min à 4°C.

Immunofluorescence :

Les cellules sont comptées, centrifugées et resuspendues à une concentration de 2.105 cellules/50 µL de milieu de culture dépourvu de SVF. Les cellules sont déposées sur des lames préalablement recouvertes de poly-L-lysine(0,1%), à laquelle elles adhèrent en 5 min à température ambiante. Les cellules sont ensuite fixées avec du para-formaldéhyde à 3% pendant 10 min à température ambiante. La perméabilisation des cellules se fait dans du tampon PBS (Phosphate Buffer Saline), Hepes 10 mM, BSA 3%, Triton X100 0,2%. Les sites non spécifiques sont saturés avec un tampon PBS, Hepes 10 mM, BSA 3%, SVF 3% pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite incubées 1H en chambre humide avec les anticorps primaires spécifiques. Après trois lavages (tampon PBS, Hepes 10 mM, BSA 3%), les cellules sont incubées pendant 1H à l’abri de la lumière avec les anticorps secondaires appropriés. Le montage des lamelles est réalisé avec le milieu de montage (Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, USA). Les lames sont conservées à 4°C à l’abri de la lumière avant d’être observées au microscope confocal Zeiss (LSM 510; Axiovert 100; Oberkochen, Allemagne) équipé d’un objectif Plan-Apochromat à immersion (x63). Les données sont analysées avec le logiciel Zeiss LSM-Image.

Immunoprécipitations (IP) et Western blot (WB)

Une étape de pré-clarification des échantillons est réalisée en incubant les lysats cellulaires à 4°C pendant 30 minutes avec 60µl de protéines G ou A (50%v/v). Les surnageants de centrifugation (6500 tours pendant 4 minutes à 4°C) sont ensuite incubés pendant 1H30 à 4°C avec 5µg d’anticorps spécifique suivi de 1H30 d’incubation supplémentaire avec 60µl de billes de sépharose couplées aux protéines A ou G. Les culots sont ensuite lavés trois fois avec le tampon de lyse et centrifugés à 6500 rpm à 4°C pendant 4 minutes avant d’être repris dans 28 µL de bleu Laemmli 1X (solution stock 3X : Tris-Cl 1 M pH 6,8, SDS 20%, glycérol 30%, β-mercapto-éthanol 1,5%, bleu de bromophénol 0,6 mg/mL).

98 Les immunoprécipités ou les lysats cellulaires sont déposés sur un gel SDS-PAGE à 9% d’acrylamide. Les protéines sont électrotransférées sur une membrane de nitrocellulose que l’on sature pendant 1H (1% BSA, 1% lait dans du Tris Buffer Saline Tween TBST : 500mM NaCl, 20mM Tris Base, 0,05% Tween 20). La membrane est ensuite incubée avec les anticorps primaires appropriés dilués dans la solution tampon de saturation. Les anticorps secondaires couplés à la préoxydase sont dilués dans le même tampon et incubés pendant 1H. La détection des protéines se fait par chimioluminescence avec le système ECL (Enhanced Chemiluminescence).

Dosage de l’activité phosphatase (tyrosine phosphatase assay, Promega®)

Ce test permet de mesurer la quantité de phosphates libres générée lors des réactions catalysées par les tyrosines phosphatases en mesurant l’absorbance (D.O) d’un complexe vert de malachite/molybdate. SHP1 est immunoprécipitée selon les conditions précédemment décrites. Il est important de ne pas ajouter d’OV dans le tampon de lyse. Le dernier des trois lavages des immunoprécipités se fait avec du tampon phosphatase (acétate de sodium 60mM, pH5,3). Les immunoprécipités sont incubés pendant 30 minutes à 30°C sous agitation (800rpm) en présence de 45µl de tampon phosphatase et de 5µl de substrat. Le substrat utilisé est un peptide synthétique phosphorylé sur tyrosine (END(pY)INASL) correspondant à un domaine de la kinase p60Src qui constitue le substrat exogène de SHP1. Les surnageants des réactions (50µl) sont transférés en plaque 96 puits. La réaction enzymatique est stoppée par l’ajout de 50µl dans chaque puits du mélange Molybdate Dye/Molybdate additive (10µl d’additive pour 1ml de dye, selon les indications du fabricant). La plaque est laissée à température ambiante pendant 15 minutes. La DO, mesurée au spectrophotomètre (LB 940 Multilabel Reader Mithras) à 620 nm, est proportionnelle à la quantité de phosphates libres et donc à l’activité enzymatique de SHP1 immunoprécipitée. Une gamme d’étalonnage constituée de quantités croissantes de phosphates est traitée parallèlement aux essais de façon à quantifier l’activité phosphatase de SHP1 exprimée en pmoles de phosphates.

Test de viabilité cellulaire MTS :

Les cellules sont ensemencées en plaque 6 puits à une concentration de 5.105 cellules/mL. Elles sont ensuite stimulées ou non par le RC-160 à des doses croissantes pendant 24 heures dans du milieu de culture contenant 1% de SVF. Après 24H d’incubation, les cellules sont homogénéisées et 3x100µL de suspension cellulaire sont prélevés pour chaque condition. Les cellules sont déposées en triplicat sur une plaque 96 puits qui est incubée à 37°C pendant 4

99 heures avec 20 µL par puits de MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3(carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium). La DO est alors mesurée aux longueurs d’onde 490nm et 620nm (référence) grâce au lecteur de plaque LB 940 Multilabel Reader Mithras (Berthold).

Tests in vivo :

5.106 cellules dans 100 µL de milieu de culture dépourvu de SVF, sont injectées en sous- cutané au niveau de la région dorsale de souris « nude » (Laboratoires Janvier, Le Genest St Isle, France). Lorsque la tumeur lymphoïde xénogreffée devient palpable (environ 10 jours plus tard), les souris sont divisées en deux lots : un lot est traité avec le RC-160 et l’autre sert de contrôle et est traité avec du sérum physiologique. Chaque souris est traitée quotidiennement pendant 28 jours par injection sous-cutané à proximité de la tumeur de 10 µg de RC-160 (50µL) ou de 50µL de sérum physiologique. Le volume tumoral en mm3 (longueur x largeur x épaisseur) est mesuré à l’aide d’un pied à coulisse tous les jours, pendant la durée du traitement. Le traitement est arrêté à 28 jours, les souris sacrifiées, et les tumeurs prélevées sont fixées ou congelés pour des analyses immuno-histochimiques ultérieures.

RÉSULTATS

Les lignées de LAGC expriment les récepteurs à la somatostatine SSTR2 et SSTR3:

Nous avons réalisé des expériences de RT-PCR afin de rechercher la présence des ARNm des différents sous types de récepteurs à la somatostatine. Seule la présence des ARNm des sous types SSTR2 et SSTR3 a été détectée dans les lignées cellulaires NPM-ALK positives SU- DHL1, Cost, Karpas 299 et Pio et dans la lignée cellulaire NPM-ALK négative, FEPD (figure 1A). Les sous types SSTR1, SSTR4 et SSTR5 ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires de LAGC. Les témoins négatifs réalisés en l’absence de reverse transcriptase ainsi qu’une digestion à la DNAse ont permis d’écarter toute contamination par l’ADN génomique. La présence du récepteur SSTR2, par lequel il est possible d’activer SHP1, a également été mise en évidence par observations en microscopie confocale à l’aide d’un anticorps polyclonal dirigé contre ce récepteur. Le marquage fluorescent montre une localisation membranaire et cytoplasmique du récepteur SSTR2 dans les 4 lignées de LAGC (figure 1B). Les témoins négatifs réalisés en parallèle utilisant du sérum de lapin non immunisé n’ont pas révélé de marquage fluorescent (non montré).

100

Figure 1 : Expression de l’ARNm des récepteurs à la somatostatine SSTR2 et SSTR3 et localisation cellulaire du récepteur SSTR2 : La figure 1A montre la migration en gel d’agarose des produits de PCR réalisées avec des amorces spécifiques du récepteur SSTR2 (panel de gauche) et SSTR3 (panel de droite), suite à la réaction de reverse transcription effectuée à partir des ARNm issues de différentes lignées de LAGC. La figure 1B montre un immunomarquage du récepteur SSTR2 réalisé avec un anticorps spécifique polyclonal et observé en microscopie confocale à fluorescence. Les résultats sont représentatifs de deux (A) et trois (B) expériences indépendantes.

L’analogue de la somatostatine RC-160 augmente l’activité phosphatase de SHP1 :

Afin d’évaluer l’effet du RC-160 sur l’activité phosphatase de SHP1, nous avons réalisé des dosages d’activité tyrosine phosphatase sur des immunoprécipités anti-SHP1. Les cellules sont traitées ou non avec 10nM de RC-160 pendant 15min et des immunoprécipitations anti- SHP1 sont réalisées. Des expériences de cinétique de traitement et d’effet dose nous ont préalablement permis de déterminer la dose et de temps de stimulation adéquats. Le dosage

101 d’activité phosphatase est effectué à l’aide d’un kit Promega (matériel et méthodes). Les immunoprécipités sont incubés en présence d’un peptide phosphorylé sur tyrosine et la quantité de phosphates libérés est evaluée par dosage colorimétrique au spectrophotomètre. Un lot de cellules non traitées permet de mesurer l’activité basale de SHP1 dans ces cellules. Deux contrôles permettent de s’affranchir des biais éventuels de ce dosage d’activité. Un premier test d’activité, effectué sur un immunoprécipité réalisé à l’aide d’un anticorps non relevant, permet de déterminer l’activité phosphatase des cellules qui ne correspond pas de façon spécifique à celle de SHP1 (valeurs que l’on retranchera aux valeurs brutes de D.O. obtenues). Un deuxième test d’activité phosphatase sur des immunoprécipités anti-SHP1 est effectué sans ajout du substrat, et vérifie ainsi l’absence de contamination de l’échantillon par du phosphate. Les quantités de SHP1 immunoprécipitées sont vérifiées pour chaque test d’activité phosphatase afin d’assurer la cohérence des interprétations. Nous avons montré qu’un traitement au RC-160 à une dose de 10nM et sous 15min de stimulation provoquait une augmentation de l’activité phosphatase de SHP1 de l’ordre de 30% dans la lignée Karpas 299 (figure 2, histogramme gauche). La même analyse effectuée sur la lignée Cost montre une augmentation d’environ 70% de l’activité phosphatase de SHP1 (figure 2, histogramme droit).

Figure 2 : Activation de SHP1 sous l’effet du RC-160 : Les cellules Karpas 299 (histogramme gauche) et Cost (histogramme droit) ont été traitées ou non avec 10nM de RC-160 pendant 15 min puis lysées. Les immunoprécipités anti-SHP1 sont incubés avec le substrat exogène END(pY)INASL. La réaction enzymatique est stoppée par l’ajout du mélange Molybdate Dye/Molybdate additive. La DO, mesurée au spectrophotomètre à 620 nm, est proportionnelle à la quantité de phosphates libres générés et donc à l’activité de SHP1 immunoprécipitée. Les quantités de SHP1 immunoprécipitées sont vérifiées par WB anti-SHP1 (résultats non représentés). Les résultats sont exprimés en moyenne +/- écart-type de 3 expériences indépendantes. En supposant une distribution homogène des échantillons, la significativité statistique des résultats a été calculée par un test de Student apparié (* : p<0,05).

102

Le traitement au RC-160 provoque une diminution de phosphorylation de NPM-ALK et de STAT3 :

Nos travaux précédents ayant caractérisé NPM-ALK comme substrat de SHP1, nous avons voulu observer l’impact du traitement au RC-160 et de l’augmentation d’activité phosphatase de SHP1 qu’il induit, sur la phosphorylation sur tyrosine de NPM-ALK et de STAT3. Les cellules Karpas 299 et Cost ont été traitées pendant 5 et 15 min avec une dose de 10nM de RC-160. Les cellules sont ensuite lysées et des immunoprécipitations anti-NPM-ALK ou anti- STAT3 sont effectuées. La révélation avec des anticorps anti-phosphotyrosine et anti- phosphoSTAT3 permet d’évaluer l’impact du traitement au RC-160 sur la phosphorylation de ces deux protéines. Nous avons ainsi mis en évidence dans la lignée Karpas 299, une diminution de la phosphorylation sur tyrosine de NPM-ALK (panel de gauche) et de (panel du milieu) après 15min de stimulation par une dose de 10nM de RC-160. Il a également été observé un retour du niveau de phosphorylation au niveau du contrôle pour des temps de stimulations plus longs (non montré). La même expérience réalisée sur les cellules Cost a permis de mettre en évidence une diminution de la phosphorylation de NPM-ALK après 15min de traitement des cellules par le RC-160 (10nM) (panel de droite).

Figure 3 : Effet du RC-160 sur la phosphorylation sur tyrosine de NPM-ALK et de STAT3 : Les cellules Karpas 299 et Cost sont traitées avec 10nM de RC-160 pendant 5 et 15 min puis des immunoprécipités anti-ALK et anti-STAT3 sont réalisés et séparés sur gel de polyacrylamide avant d’être soumis à un western blot anti-phosphotyrosine (panels de gauche et droite) ou anti- phosphoSTAT3 Y705 (panel du milieu). Les membranes sont ensuite déshybridées puis réhybridées avec des anticorps anti-ALK et anti-STAT3 afin de déterminer la quantité de protéines immunoprécipitée. Les résultats sont représentatifs de trois (NPM-ALK et STAT3 dans Karpas 299) et deux (NPM-ALK dans Cost) expériences indépendantes.

103

Le traitement au RC-160 induit une diminution de la viabilité des cellules Cost :

Afin d’évaluer le rôle du RC-160 sur l’oncogénicité de NPM-ALK nous avons effectué des expériences de mesure de viabilité cellulaire. Les cellules Cost et Karpas 299 sont traitées par des doses croissantes de RC-160 pendant 24H puis un test de viabilité MTS est effectué. Nous avons ainsi mis en évidence une diminution progressive dose dépendante de la viabilité des cellules Cost. La figure 4 montre que la stimulation des cellules Cost par de faibles doses de RC-160 (1 et 10 nM) réduit d’environ 20% la viabilité cellulaire en comparaison avec les cellules non traitées. Un effet inhibiteur significatif (environ 40% d’inhibition) est obtenu après stimulation des cellules Cost pendant 24 heures aux doses de 100 nM et de 500 nM de RC-160 (figure4, histogramme gauche). Par contre, la même expérience réalisée sur les cellules Karpas 299 ne nous a pas permis de mettre en évidence d’effet du RC-160 sur la viabilité de ces cellules (figure 4, histogramme droit).

Figure 4 : Effet du RC-160 sur la viabilité des cellules Cost et Karpas 299: Un test de viabilité MTS est réalisé sur des cellules Cost (histogramme gauche) et Karpas 299 (histogramme droit) traitées ou non pendant 24 heures par des doses croissantes de RC-160. Les résultats représentent la moyenne +/- écart type de 5 expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée avec un test de Student (* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001).

Le traitement au RC-160 induit une régression tumorale in vivo :

Afin d’évaluer le potentiel anti-tumoral du RC-160 sur des tumeurs NPM-ALK positives, nous avons procédé à des expérimentations in vivo. Pour cela, nous avons xénogréffé en sous cutané, la lignée cellulaire Cost (5.106 cellules) dans 10 souris nude athymiques. Dès l’apparition d’une tumeur palpable, les souris sont traitées quotidiennement par des injections sous cutanés à proximité de la tumeur, soit avec du sérum physiologique (souris contrôles), soit avec du RC-160 à une dose de 10µg/souris (souris traitées). Les tumeurs sont mesurées quotidiennement à l’aide d’un pied à coulisse (longueur, largueur, épaisseur) afin d’évaluer le

104 volume tumoral. Les souris sont sacrifiées 28 jours après la xénogreffe. Malgré le faible rendement des xénogreffes, quatre souris ont développé des tumeurs et ont été réparties en deux groupes de deux souris. Alors que le volume des tumeurs des deux souris contrôles a augmenté de façon progressive au cours des 28 jours d’expérimentation pour atteindre de valeurs de 755 et 490 mm3, celui des deux souris traitées a diminué pour l’une (33mm3) et s’est maintenu pour l’autre (178 mm3). Cette expérience préliminaire permet de dégager une tendance en faveur d’un rôle d’inhibition de la croissance des tumeurs NPM-ALK positives joué par le RC-160. Ces expériences nécessitent d’être répétées avec un plus grand nombre d’animaux afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il est également nécessaire de standardiser et d’améliorer le protocole en débutant le traitement par le RC-160 lorsque le volume tumoral atteint une valeur prédéfinie et en utilisant des souris SCID qui permettent un meilleur rendement des xénogreffes.

Figure 5 : Effet du RC-160 in vivo : Des xénogreffes de 5x106 cellules Cost ont été effectuées sur 4 souris nude. Lorsque la tumeur est palpable (environ 10 jours après la xénogreffe), deux souris sont traitées par des injections sous-cutanées à proximité de la tumeur de RC-160 à la dose de 10µg/souris (RC-160), et deux sont traitées par du sérum physiologique (Ctrl). Les injections ont lieu quotidiennement pendant 28 jours. Le volume tumoral en mm3 (longueur x largeur x épaisseur), proportionnel à la croissance de la tumeur, est mesuré aux jours indiqués.

105

Discussion :

Nous avons décrit le rôle négatif de la protéine SHP1 sur l’oncogène NPM-ALK et son effet transformant dans les LAGC. Dans la continuité de ce travail nous avons recherché un moyen de stimuler l’activité phosphatase de SHP1 dans les lignées de LAGC NPM-ALK positives afin de diminuer le pouvoir transformant de NPM-ALK et de placer cette phosphatase au centre de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Les travaux du Dr. Susini sur le rôle d’un neuropeptide dans les cellules pancréatiques