Implication de tyrosine-phosphatases dans l’apoptose induite par l’acide ursolique dans les cellules de LAGC ALK positives :

Introduction :

L’acide ursolique est un composé triterpenoïde pentacyclique retrouvé de façon naturelle dans une grande variété de produits alimentaires d’origine végétale ou de plantes médicinales. Il a été décrit comme étant un agent chimio préventif ayant une action antiproliférative sur les cellules cancéreuses427. Il diminue notamment la prolifération de plusieurs lignées cellulaires issues de cancers d’origine hématopoïétique, induit l’apoptose428, inhibe la progression tumorale ainsi que l’angiogenèse429. Il a également été montré qu’il induit l’apoptose de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans les propriétés anti-tumorales de ce composé restent mal compris. Ils pourraient être expliqués par une inhibition de la réplication de l’ADN430, une inhibition des PTKs, une activation des caspases ou encore l’augmentation du taux de Ca2+ intracytoplasmique. Un autre mécanisme d’apoptose induite par l’acide ursolique met en jeu l’inhibition de gènes inhibiteurs de l’apoptose ainsi que l’inhibition de l’activité de NF-kB431,

432

. Afin d’en augmenter l’efficacité, plusieurs modifications de la substance naturelle ont été effectuées. Ainsi, deux dérivés puissants : le 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid (CDDO) et son dérivé methyl ester (CDDO-Me), sont utilisés en phase I d’essai clinique pour le traitement des leucémies et de tumeurs solides. En effet, le CDDO induit l’apoptose des cellules primaires de patients atteints de leucémies et de myélomes, résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. De plus, il a été montré que cette molécule n’est pas toxique pour les lymphocytes normaux issus des mêmes patients ou de volontaires sains, et ce, aux concentrations utilisées pour induire l’apoptose des cellules cancéreuses. Enfin, il a été montré récemment que l’acide ursolique induit l’expression de SHP1 dans des cellules de myélomes multiples433 et de cancer du poumon434. Cette expression se traduit par une inhibition de la voie STAT3, une diminution de la prolifération cellulaire433 et une induction de l’apoptose434.

Dans cette étude nous avons testé l’efficacité du traitement à l’acide ursolique sur une lignée cellulaire de LAGC exprimant NPM-ALK et n’exprimant pas SHP1, la lignée SU- DHL1. Nous avons montré que l’acide ursolique provoque sur cette lignée cellulaire, une diminution de la phosphorylation de NPM-ALK, de STAT3 et de la PLCγ1 ainsi qu’une dégradation de la protéine oncogénique. Cette diminution de la phosphorylation de NPM-

110 ALK est dépendante de l’activité des tyrosine-phosphatases intracellulaires. Cependant, dans cette lignée, l’acide ursolique n’induit pas la réexpression de SHP1. Par contre, nous avons mis en évidence une augmentation de l’activité de plusieurs tyrosine-phosphatases dont une majoritaire à un poids moléculaires d’environ 55kDa. L’acide ursolique provoque une inhibition de la prolifération cellulaire impliquant l’activité des PTPs de façon dose- dépendante. Enfin, nous avons observé une induction de l’apoptose dépendante de l’activation des caspases 3 et 7.

Matériel et méthodes :

Culture cellulaire et produits :

La lignée humaine SU-DHL1, dérivée d’un patient atteint de LAGC de type commun NPM- ALK positif, provient de l’American Type Culture Collection (ATCC). Elle est cultivée dans le milieu IMDM (Iscove Modified Dulbecco’s Medium) supplémenté par 15% de sérum de veau fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine (L-Glu), 1 mM de pyruvate de sodium (PyNa) et 20 µg/ml de pénicilline/streptomycine (PS). La culture cellulaire est effectuée dans un incubateur à 37° sous une atmosphère à 5% de CO2.

L’acide ursolique et l’orthovanadate sont fournis par Sigma-Aldrich. L’anticorps anti-ALK et les anticorps secondaires couplés à HRP proviennent de Dako. L’anticorps anti-PLCγ1 provient de Santa Cruz. Les anticorps anti-STAT3, anti-phosphoSTAT3 (Y705), anti- phosphoPLCγ1 (Y783) et anti-phosphoALK (Y1604) sont obtenus auprès de Cell Signaling Technology. L’anticorps anti-phosphotyrosine 4G10 est fourni par Upstate Biotechnology. Enfin, les billes d’agarose couplées aux protéines A ou G proviennent de Pharmacia.

Lysats cellulaires et immunoprécipitations :

Les cellules SU-DHL1 (5.106) sont lysées dans 600 µL de tampon de lyse RIPA (Radioimmune Precipitation Assay : 20mM Tris base ; 150mM NaCl ; 4 mM EDTA ; 0,5% TritonX100 ; pH7.4 ; inhibiteurs de protéases: 10µg/ml leupeptine, 2µg/ml aprotinine, 10 µM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ; inhibiteurs de phosphatases : 1mM orthovanadate). Les lysats cellulaires sont incubés pendant 30 min à 4°C sous agitation puis soumis à sonication (3x10s). L’homogénat cellulaire est centrifugé pendant 4 min à 13000 rpm et le surnageant est conservé pour être soit migré sur un gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), soit soumis à immunoprécipitation. Dans ce dernier cas, les lysats cellulairessont ensuite incubés

111 pendant 30min avec 50 µL d’une suspension à 50% de billes d’agarose couplées à la protéine A ou G dans le but d’éliminer des protéines adsorbées de façon aspécifique aux billes. Après centrifugation à 6500 rpm et élimination des billes d’agarose, 5µg d’anticorps primaire spécifique de la protéine à immunoprécipiter, sont rajoutés au surnageant. Le mélange est maintenu sous agitation douce pendant 1H30min à 4°C puis 50µl de billes d’agarose (v/v) couplées aux protéines A ou G sont ajoutés et incubés à 4°C pendant 1H30min. Les immunoprécipités sont lavés 3 fois avec le tampon RIPA et l’immunocomplexe est repris par 25 µL de tampon de Laemmli (500mM Tris-HCl, 100mM DTT (dithiothréitol), 2% SDS (dodécyl sulfate de sodium), 0.1% bleu de bromophenol, 10% glycerol; pH 6.8). Les complexes protéiques sont ensuite analysés par la technique de western blot.

Immuno-empreinte (Western- Blot) :

Les lysats ou les immunoprécipités sont incubés à 100°C pendant 3min afin de dénaturer les protéines. Ils sont ensuite soumis à une migration SDS-PAGE (sodium Dodecyl Sulfate- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose puis la membrane est incubée pendant 1H à température ambiante avec du tampon Tris Buffer Saline Tween (TBST) (500mM NaCl, 20mM tris base, 0.05% Tween 20) contenant 1% de lait et 1% de BSA (Sérum Albumine Bovine). Les membranes sont incubées une nuit à 4°C avec les anticorps primaires adéquats. Après plusieurs lavages avec du TBST, les membranes sont incubées 1H à température ambiante avec un anticorps secondaire marqué à la peroxydase (HorseRadish Peroxidase : HRP). La détection des protéines se fait par chimioluminescence avec le système ECL. D’autres expériences ont été réalisées avec le système d’imagerie infrarouge Odyssey suivant le protocole fourni par le fabricant. Dans ce cas, les membranes sont saturées dans le tampon de blocage Odyssey. Les anticorps primaires sont dilués dans ce même tampon de blocage contenant 0.2% de Tween20 et incubés avec les membranes pendant 1H à température ambiante. Les membranes sont lavées 3 fois 5 min avec du PBS (Phosphate Buffer Saline) contenant 0.1% de Tween20. Les anticorps secondaires marqués avec des fluorochromes sont dilués dans le tampon de blocage Odyssey contenant 0.2% de Tween20 et sont incubés pendant 1H à température ambiante à l’abri de la lumière. Les membranes sont ensuite lavées avec du PBS et la fluorescence est mesurée aux deux longueurs d’ondes de 680 et 800nm avec le spectrofluorimètre Odyssey. Les résultats sont ensuite analysés avec le logiciel Odyssey. Ce nouvel outil performant permet de

112 déterminer de façon précise le rapport : taux de phosphorylation de la protéine/quantité de protéine.

Essai kinase In vitro (IVK) :

Les cellules SU-DHL1 (5.106 cellules) sont traitées pendant 17H avec de l’acide ursolique à (50µM) ou du DMSO (contrôles) dans du milieu de culture: IMDM + L-Glu + PyNa + PS + 10% de SVF. Un pré-traitement de 1H suivi des 17H d’incubation avec 100µM d’orthovanadate (OV) est réalisé dans certains cas. Les cellules sont lysées avec 600µL de RIPA 1X + OV + PMSF + anti-protéases et les immunoprécipitations dirigées contre NPM- ALK sont réalisées comme décrites précédemment.

Les immunoprécipités sont lavés deux fois avec du tampon RIPA et une fois avec le tampon de réaction kinase (50mM Tris-HCl, 2.5mM MnCl2, 5mM MgCl2, pH 7.4). Les immunoprécipités sont ensuite resuspendus avec 40 µL de tampon kinase contenant 10 µCi de [γ-32P] ATP et 10µM d’ATP non radioactif et incubés à 30°C pendant 30 min sous agitation. La réaction est arrêtée par l’ajout de 10 µL de tampon de Laemmli concentré 5 fois. Les immunoprécipités sont ensuite soumis à une migration sur gel de polyacrylamide (SDS- PAGE). Le gel est coloré au bleu de coomassie, séché et la radioactivité est analysée au phosphorimager.

Essai In-Gel Phosphatase :

Les cellules SU-DHL1 (5.106 cellules) sont traitées pendant 4H ou 17H soit avec du DMSO (contrôles), soit avec 25 ou 50µM d’acide ursolique dans du milieu de culture: IMDM + L-Glu + PyNa + PS + 10% de SVF. Les cellules sont lysées dans 240µL de tampon RIPA 1X + OV + PMSF + anti-protéases, auxquels sont ajoutés 60µL de tampon de Laemmli.

Ces expériences sont réalisées selon le protocole de Burridge et Nelson (1995) avec quelques modifications. En résumé, NPM-ALK est immunoprécipité et incubé sur la nuit à 30°C avec 2 mg de poly (Glu4-Tyr1). Ce substrat des PTPs est phosphorylé par la kinase NPM-ALK en présence de 20 µCi [γ-32

P] ATP de la même manière que pour l’essai kinase décrit plus haut. Aprés centrifugation à 4°C (13000rpm, 5min), le surnageant est récupéré et incubé pendant 30min dans la glace avec un volume égal d’acide trichloroacétique à 20%. Le poly (Glu-Tyr) phosphorylé est ensuite récupéré dans le culot de centrifugation à 4°C (13000rpm, 10min). Le substrat radiomarqué des PTPs est repris dans du tampon Tris 0.75M, pH 8.8 et incorporé

113 dans le gel de séparation du SDS-PAGE. Apres séparation et renaturation, les activités PTPs sont révélées par analyse de la radioactivité au phosphorimager (hydrolyse du substrat radioactif).

Test de viabilité cellulaire :

Les cellules SU-DHL1 sont comptées et diluées à 2.104 cellules/ml dans du milieu de stimulation : IMDM + L-Glu + PyNa + PS + 10% de SVF. Elles sont ensuite traitées avec du DMSO (contrôles) ou avec des concentrations croissantes d’acide ursolique (1, 5, 10, 15, 20, 25 et 50µM). Puis, 100µl (2.103 cellules) de ces dilutions sont ensemencés en triplicat dans des plaques 96 puits. 20µl de MTS, sel de tetrazolium, (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5- (3(carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tetrazolium) à une concentration finale de 1mg/ml, sont ajoutés dans chaque puits et les cellules sont incubées à 37°C pendant 4 heures. Le MTS est métabolisé par les mitochondries en un produit coloré (formazan) détectable au spectrophotomètre (Mithras, Berthold). Le différentiel de densité optique (D.O 490 nm - D.O 620 nm) mesuré est corrélé au nombre de cellules vivantes. Cette mesure a été réalisée à 0, 24, 48 et 72 heures après ensemencement des cellules.

Test d’activité caspase 3/7 (caspase-Glo Promega):

Les cellules SU-DHL1 sont ensemencées en plaque 12 puits à une concentration de 105 cellules/mL dans du milieu de stimulation : IMDM + L-Glu + PyNa + PS + 10% de SVF. Les cellules sont ensuite traitées avec du DMSO (contrôles) ou des concentrations croissantes d’acide ursolique de 1, 10, 25, 50 ou 100µM. Dans certaines expérimentations, un pré- traitement avec 100µM d’orthovanadate pendant 1H est réalisé avant les 4H de traitement avec l’acide ursolique. Après homogénéisation, 3x100µL, soit 104 cellules/100µL, de chaque suspension cellulaire sont prélevées et ensemencés en triplicat en plaque blanche 96 puits pour mesure de luminescence. Des contrôles sont effectués avec du milieu seul, du milieu avec acide ursolique ou des cellules non traitées afin de s’assurer du niveau basal d’activation des caspases 3/7 dans les cellules non traitées et qu’aucun produit (milieu, acide ursolique) n’interfère avec la réaction. Après incubation, la plaque est laissée à température ambiante avant d’ajouter 100µL/puits de réactif caspase-glo selon les recommandations du protocole fourni avec le kit de dosage. La plaque est laissée à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 2H puis lue avec le lecteur de plaque Mithras (Berthold) en luminescence.

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Mesure de l’apoptose par marquage à l’annexine V et cytométrie en flux :

Les cellules SU-DHL1 (106) sont incubées en présence de DMSO (contrôles) ou de doses croissantes d’acide ursolique (1, 10, 25, 50 ou 100µM) pendant 4H. Elles sont ensuite centrifugées et lavées au PBS avant d’être incubées pendant 15min à température ambiante dans un tampon HEPES contenant l’IP et l’Annexine V. Des contrôles sont réalisés avec des cellules non marquées ou marquées avec l’IP seul ou l’Annexine V seule, afin de régler le cytomètre. Suite à l’incubation, les cellules sont diluées dans le tampon HEPES et le marquage est analysé en cytométrie en flux (FACSCAN).

Résultats :

L’acide ursolique entraine la déphosphorylation de NPM-ALK, de STAT3 et de la PLCγ1 et diminue l’activité kinase de NPM-ALK de façon dépendante de l’activité des tyrosine-phosphatases:

Les cellules SU-DHL1 ont été incubées pendant 17H avec 50µM d’acide ursolique ou un volume équivalent de DMSO (diluant de l’acide ursolique) comme contrôle. Les lysats cellulaires ont ensuite été soumis à une migration sur gel de polyacrylamide suivie d’un western blot. La révélation a été réalisée à l’aide de l’imageur Odyssey. La figure 1A montre une diminution de la phosphorylation de NPM-ALK sur la Y664 sous l’effet du traitement à l’acide ursolique. Le rapport NPM-ALK phosphorylée/NPM-ALK diminue de façon significative dans les cellules traitées avec 50 µM d’acide ursolique. Le panel de droite montre qu’un pré-traitement à l’orthovanadate inhibe l’effet de l’acide ursolique sur la diminution de phosphorylation de NPM-ALK, indiquant donc que les PTPs jouent un rôle majeur dans cette déphosphorylation. Une diminution de la quantité de NPM-ALK a également été observée suite au traitement. La figure 1B montre que l’activité kinase de NPM-ALK diminue de façon significative sous l’effet du traitement à l’acide ursolique. Cette diminution d’activité de NPM-ALK n’est pas retrouvée lorsque les cellules sont traitées avec un inhibiteur des PTPs. L’acide ursolique provoque également une nette diminution de la phosphorylation de STAT3 et de PLCγ1. Cet effet de l’acide ursolique est bloqué en présence d’orthovanadate (Figure 1C et 1D). Ces résultats indiquent que l’acide ursolique provoque une diminution de la phosphorylation et de l’activité de l’oncogène NPM-ALK ainsi que de ces effecteurs en aval que sont STAT3 et la PLCγ1.

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Figure 1 : Effet de l’acide ursolique sur la phosphorylation de NPM-ALK, STAT3 et PLCγ1 et sur l’activité de NPM-ALK : La figure 1Areprésente le niveau de phosphorylation de NPM-ALK suite au traitement de 17H avec 50µM d’acide ursolique par rapport au contrôle non traité. Le rapport NPM-ALK phosphorylé/NPM-ALK est indiqué en bas de la figure. L’effet du traitement à l’orthovanadate (OV) sur la phosphorylation est représenté à droite. La figure 1B représente le test d’activité kinase in vitro (IVK) de NPM-ALK dans les cellules contrôles, traitées avec l’acide ursolique seul ou en combinaison avec l’orthovanadate (OV). La figure 1C représente le niveau de phosphorylation de STAT3 sur la Y705 sous l’effet du traitement de 17H à l’acide ursolique (50µM). De la même manière que sur la figure 1A, sont représentés le ratio phosphoSTAT3/STAT3 ainsi que l’effet de l’orthovanadate (OV) sur la phosphorylation. La figure 1D représente le niveau de phosphorylation de la PLCγ1 suite au traitement de 17H à l’acide ursolique (50µM). Le panel du haut montre la phosphorylation globale sur tyrosine de la PLCγ1, le panel intermédiaire la quantité de protéine immunoprécipitée et le panel du bas, la phosphorylation sur la Y783 de la PLCγ1. Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes (A,C,D) et deux expériences indépendantes (B).

L’acide ursolique provoque l’activation des tyrosine-phosphatases :

Les cellules SU-DHL1 ont été traitées par 25 ou 50µM d’acide ursolique pendant 4H ou 17H. Les lysats des cellules contrôles et traitées ont été analyses par la technique « in-gel phosphatase » afin de visualiser l’activité des PTPs intracellulaires. La figure 2 montre une activation de plusieurs phosphatases sous l’effet du traitement à l’acide ursolique par rapport

116 au contrôle des cellules non traitées. En particulier, l’activité de protéines phosphatases migrant à des poids moléculaires voisins de 55kDa augmente significativement à la dose de 50µM, alors que la quantité de protéines totales colorées au bleu de coomassie ne varie pas.

Figure 2 : Activation des tyrosine-phosphatases intracellulaires par le traitement à l’acide ursolique : La figure 2A représente l’activité des PTPs de la lignée SU-DHL1 dans les cellules contrôles non traitées et après traitement par deux doses d’acide ursolique (25 et 50µM) pendant 4H (panel de gauche) et 17H de traitement (panel de droite). La figure 2B représente les gels SDS-PAGE colorés au bleu de coomassie afin de s’assurer de la quantité de protéines présentes dans les lysats cellulaires. Les résultats sont représentatifs de 3 expériences indépendantes.

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L’acide ursolique affecte la viabilité cellulaire de façon dépendante de l’activité des tyrosine-phosphatases :

Nous avons testé les propriétés antiprolifératives de l’acide ursolique sur les cellules SU-DHL1 à l’aide d’un test de viabilité MTS. La figure 3A montre une diminution de viabilité des cellules SU-DHL1 de façon dose dépendante. La viablilité des cellules traitées par l’acide ursolique diminue de façon significative dès 24H de traitement alors que les cellules contrôles non traitées prolifèrent de façon exponentielle. Nous observons également que de faibles concentrations d’acide ursolique (1 à 15µM) conduisent à une diminution significative de la viabilité à 48 et 72H alors que des concentrations supérieures à 20µM entrainent un arrêt total de la prolifération. Un test de viabilité au bleu trypan a donné des résultats identiques montrant que le traitement des cellules SU-DHL1 par l’acide ursolique pendant 17H, diminue la viabilité cellulaire de façon dose dépendante. Ces résultats indiquent que l’acide ursolique induit un effet antiprolifératif à des concentrations relativement faibles avec un IC50 de l’ordre de 10µM. De façon intéressante, le traitement des cellules par l’orthovanadate inhibe complètement l’effet antiprolifératif de l’acide ursolique sur les cellules SU-DHL1 (Figure 3B). Ces résultats indiquent que l’effet antiprolifératif de l’acide ursolique implique d’une façon directe ou indirecte des PTPs.

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Figure 3 : Effet du traitement à l’acide ursolique sur la viabilité des cellules SU-DHL1 :

La Figure 3A représente un test de prolifération MTS sur des cellules SU-DHL1 traitées avec des doses croissantes d’acide ursolique pendant 24, 48 et 72H. La figure 3B représente les pourcentages de prolifération cellulaire (MTS) des cellules traitées par 10 et 25µM d’acide ursolique pendant 17H par rapport au contrôle non traité. Le diagramme de gauche (noir) représente la viabilité de cellules traitées avec l’acide ursolique et celui de droite (blanc) représente la viabilité de cellules pré-traitées à l’orthovanadate (100µM-1H) puis traitées à l’acide ursolique (17H). Les résultats représentent la moyenne +/- écart type de trois expériences indépendantes (3A) et la moyenne de deux expériences indépendantes (3B).

L’acide ursolique induit l’apoptose des cellules SU-DHL1 :

Afin d’étudier le pouvoir apoptotique de l’acide ursolique sur les cellules SU-DHL1, nous avons incubé les cellules avec différentes concentrations de drogue pendant 4H et nous avons analysé les activités des caspase 3 et 7 comme décrit dans matériel et méthodes. Les résultats indiquent que l’acide ursolique augmente de façon dose dépendante l’activité de ces caspases 3 et 7 (Figure 4A). Le traitement des cellules avec 100µM d’orthovanadate de sodium inhibe partiellement l’activation des caspases (Figure 4B). Ces résultats suggèrent que les tyrosine-phosphatases participent aux processus d’apoptose induits par l’acide ursolique.

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Figure 4 : Activation des caspases 3/7 dans les cellules SU-DHL1 par le traitement à l’acide ursolique : La figure 4A représente le niveau d’activation des caspases 3/7 en fonction de la dose d’acide ursolique. Les résultats sont exprimés en nombre de fois d’augmentation par rapport au contrôle (cellules traitées avec du DMSO). La figure 4B représente le niveau d’activation des caspases 3/7 sous l’effet du traitement à l’acide ursolique sans (histogramme noir de gauche) ou avec (histogramme blanc de droite) traitement à l’orthovanadate (100µM). Les résultats représentent la moyenne +/- écart type de trois expériences indépendantes.

L’évaluation de l’apoptose des cellules par un marquage à l’annexin V montre que des doses de 1 à 10µM d’acide ursolique n’induisent pas d’apoptose majeure alors que des concentrations plus élevées (25 à 100µM) augmentent de façon significative l’apoptose cellulaire et la perte de la perméabilité membranaire sélective (Figure 5).

120 DMSO 580 224 2.79 87.98 2.99 6.23 UA 100µM 18.81 43.56 2.99 34.63 UA 1µM 2.12 89.27 5.66 2.95 UA 10µM 6.08 2.34 88.72 2.87 UA 25µM 86.13 3.16 3.08 7.63 UA 50µM 3.02 77.47 13.94 5.58

Figure 5 : Le traitement à l’acide ursolique induit l’apoptose des cellules SU-DHL1 :

Evaluation de la population cellulaire en apoptose par un double marquage à l’annexine V et à l’iodure de propidium (IP) et analyse en cytométrie de flux. Les cellules SU-DHL1 sont traitées pendant 4H avec des doses croissantes d’acide ursolique puis incubées avec l’Annexine V fluoresceine et l’IP. La population cellulaire marquée est analysée par cytométrie en flux. Dans chaque zone est indiqué le pourcentage de la population cellulaire non marquée (bas-gauche), marquée à l’annexine V (bas- droite), doublement marquée à l’annexine V et à l’iodure de propidium (haut-droite) ou marquée à l’iodure de propidium (haut-gauche). Les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

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Discussion :

Les travaux de Pathak, AK et al.433 ont montré une expression de SHP1 sous l’effet du traitement à l’acide ursolique sur des cellules de myélome multiple. De plus, les auteurs ont mis en évidence que le traitement à l’acide ursolique permet une inhibition de la voie de signalisation de STAT3, qui, comme nous l’avons vu, est une protéine jouant un rôle majeur dans le pouvoir oncogènique de NPM-ALK. Cette inhibition de la voie STAT3 par le traitement à l’acide ursolique est dépendante de l’expression de SHP1 induite par le traitement. Même si le mécanisme par lequel l’acide ursolique permet l’expression de SHP1 n’est pas décrit dans cet article, on peut penser que son action est peut être plus spécifique que