3. Méthodologie de synthèse et de caractérisation des produits 58
3.3. Revêtements d'hydrogels de PEG encapsulant des MSN-DTPA-Gd 65
La réticulation sous UV de l'hydrogel requiert le mélange de plusieurs produits. Outre le polymère, un photo-initiateur est nécessaire. Un photo-initiateur UV a été choisi, l'Irgacure 184 (1-Hydroxy-cyclohexyl-phenyl- ketone) (Figure 46). Une coupure de type Norrish I17 a lieu sous l'effet de la lumière UV.[202] On a alors deux radicaux libres et le radical benzoyle issu de cette coupure est connu pour sa grande réactivité avec les monomères acryliques.
Figure 46. Molécule de l'Irgacure 184 (1‐Hydroxy‐cyclohexyl‐phenyl‐cétone) à gauche, de la triéthanolamine au centre et du 1‐vinyl‐2‐pyrrolidone à droite.
Un donneur électronique, la triéthanolamine (TEA), agissant comme un co-initiateur par activation d'un radical -amino, a été ajouté pour optimiser la réticulation. Un catalyseur a aussi été utilisé pour accélérer la cinétique de réticulation. Le 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) est un co-polymère qui accroit le taux de réticulation
sans contribuer à la formation du réseau tridimensionnel de l'hydrogel.[203] Les deux molécules sont représentées dans la Figure 46. Enfin, pour accroitre la viscosité du précurseur, de la silice fumée en chaînes agglomérées de 0.2 à 0.3 µm de longueur, a été insérée dans le mélange. L'ensemble des produits a été dissous dans la suspension aqueuse contenant les MSN-DTPA-Gd préparées tel que décrit dans la section 3.1.
Le choix des produits composant l'hydrogel s'est fait en tenant compte de la biocompatibilité des produits. Les principales études de non cytotoxicité18 des composants du précurseur d'hydrogel sont listées dans le Tableau 9.
Tableau 9. Principales études de biocompatibilité ou de cytotoxicité pour les produits composant le précurseur d'hydrogel.
Produit Travaux sur la cytotoxicité
Poly (éthylène glycol) [204] Le chapitre 3 de ce livre regroupe les principales études de toxicité du PEG et
confirme que ce polymère peut être utilisé pour des applications biomédicales Irgacure 184 (1-Hydroxy-
cyclohexyl-phenyl-ketone) [205]
Cette étude de la cytocompatibilité de différents photo-initiateurs confirme la non-toxicité de l’Irgacure 184
Triéthanolamine [206] Ce rapport démontre que la TEA n’est pas toxique à l’ingestion et au contact
cutané
N-Vinylpyrrolidone [207] Cet article rapporte la biocompatibilité du NVP dans des applications
biomédicales
Silice fumée [208] Ce livre regroupe de nombreuses études de l’effet des particules de silice sur
la santé et confirme la non-toxicité de la silice fumée
Méthodologie de la préparation de l'hydrogel paramagnétique
Les produits sont quantifiés pour obtenir la concentration finale suivante :
un pourcentage massique de 5 wt% en PEG(20000 Da, Laysan Bio Inc., Arab, AL, USA); un pourcentage massique de 1 wt% en HPK (Sigma-Aldrich, Canada);
une concentration de 225 mM en TEA (Sigma-Aldrich, Canada); et une concentration de 37 mM en NVP (Sigma-Aldrich, Canada).
Les produits sont ensuite dispersés dans la solution de MSN-DTPA-Gd par une sonification de 15 à 45 min à 50 °C. La réticulation est ensuite effectuée par insertion du précurseur dans une chambre à UV d'une longueur d'onde de 365 nm et d'une puissance de 5 mW cm-². Après 15 min, l'hydrogel est réticulé. Il est conservé à température ambiante et réhydraté après toute analyse se déroulant plus de 24 h après la réticulation.
3.3.2. Caractérisation de l'hydrogel
Profils de NMRD
Les profils NMRD (Nuclear Magnetic Relaxation Dispersion) du précurseur d'hydrogel et de l'hydrogel réticulé ont été mesurés entre 0.015 MHz et 40 MHz avec un relaxomètre à champs rapides Spinmaster (Stelar, Mede, Italie). Le temps de relaxation longitudinal (T1) a été mesuré à 20, 29, 39, 60 et 300 MHz en utilisant des
relaxomètres Bruker MiniSpec (20, 29, 39 et 60 MHz) et Bruker ANX300 (300 MHz). La température a été fixée à 37 °C pour toutes les mesures et le temps d'écho standard était de 1 ms. Les taux de relaxation (1/T1) ont été
normalisés par rapport à la concentration en Gd3+ pour calculer les relaxivités (r1).
Piégeage des MSN‐DTPA‐Gd dans l'hydrogel
L'efficacité de l'hydrogel à piéger les MSN-DTPA-Gd a été vérifiée en visualisant l'hydrogel en IRM. Dans une plaque de 96 puits, 200 µL d'eau et 100 µL d'une gélatine porcine de type A à 5 wt% ont été déposés dans deux rangées. Dans trois autres rangées, 100 µL de cette même gélatine ont aussi été déposés puis après durcissement de cette dernière, 100 µL de MSN-DTPA-Gd en suspension ont été ajoutés dans la première rangée, 100 µL de précurseur d'hydrogel sans MSN-DTPA-Gd dans la seconde et enfin 100 µL d'hydrogel avec MSN-DTPA-Gd dans la troisième. Les précurseurs d'hydrogels ont été préparés comme décrit dans la section 3.3.1.
La plaque a été placée 15 min sous UV ( = 365 nm, 5 mW cm-²) pour la réticulation de l'hydrogel et ensuite insérée dans une bobine radio fréquence adaptée pour les plaques de 96 puits puis scannée avec un appareil IRM pour l'imagerie du petit animal de 1 T (M2M, Aspect Imaging, Netanya, Israël). Une séquence écho de spin pondérée en T1 a été utilisée avec les paramètres suivants : TR de 785 ms, TE de 16 ms, matrice
de 512x512, épaisseur de tranche de 0.9 mm, champ de vue de 70 mm et 5 excitations, avec une durée d'acquisition de 33 min et 28 s. La plaque a ensuite été conservée à 4 °C et imagée à nouveau avec les mêmes paramètres deux mois après.
Détection de faibles volumes d'hydrogel
Des gouttes de 0.25 µL, 0.5 µL, 1 µL, 2 µL et 5 µL de précurseur d'hydrogel contenant des MSN-DTPA-Gd ont été déposées en triplicata dans une plaque de 96 puits et placées sous UV pendant 15 min ( = 365 nm, 5 mW cm-²). Avant d'être imagées, les gouttes ont été recouvertes de 200 µL d'eau. La plaque a ensuite été insérée dans une bobine radio fréquence adaptée pour les plaques de 96 puits et imagée avec une séquence écho de spin pondérée en T1 avec les paramètres : TR de 400 ms,
TE de 15.3 ms, matrice de 400x400, épaisseur de tranche de 0.5 mm, champ de vue de 70 mm et 1 excitation, avec une durée d'acquisition de 2 min et 40 s.
En utilisant le logiciel Image J, le volume final des gouttes a été quantifié. Pour chaque goutte, les pixels contigus ayant une intensité de 1.5 fois celle de l'eau ont été sélectionnés. L'opération a été répétée pour chaque tranche adjacente et les pixels ont été additionnés. La somme de ces pixels a été multipliée par le volume du voxel pour obtenir le volume final des gouttes après réticulation et réhydratation de l'hydrogel.
Mesures de viscosité
Les analyses rhéologiques ont été réalisées avec un rhéomètre (AR-G2, TA Instrument, Wilmington, PA, USA) à géométrie de type cône–plan (60 mm, 2°) avec un plateau Peltier pour contrôler la température. Les mesures de viscosité ont été faites à des taux de cisaillement entre 10 et 100 s-1 pour quatre températures : 23 °C (température ambiante), 30 °C, 40 °C et 50 °C. Avant toute mesure, les échantillons ont été pré-cisaillés à 1 s-1 et laissés au repos pendant 3 min pour se prémunir de toute trace de cisaillement causé par la préparation ou la manipulation des échantillons.
3.3.3. Nettoyage du titane et greffage du phosphate acrylate
Les tests préliminaires de nettoyage et de greffage sur le titane ont été réalisés sur des feuillets de titane de 0.127 mm d'épaisseur (pureté de 99.6%, Goodfellow, Huntingdon, Angleterre) coupés en carrés de 1x1 cm. Les analyses sont en effet plus faciles à réaliser sur des substrats plats. Une fois les procédures de lavage et de greffage optimisées, cette procédure de nettoyage et de traitement du titane par phosphate acrylate, a été appliquée aux aiguilles. Les procédures de nettoyage développées sont décrites en Annexe D.
Les substrats de titane nettoyés sont traités au moyen de phosphate acrylate. Pour ce faire, ils sont immergés dans une solution aqueuse de 4-hydroxybutyl acrylate phosphate (Monomer-Polymer and Dajac Labs, Feasterville-Trevose, PA, USA), sous agitation et à température ambiante. Dans un premier temps, une concentration de 1 mg mL-1 a été testée sur 1 h, 4h et 8h. Suite aux résultats des analyses, une concentration plus élevée (5 mg mL-1) a été essayée pendant 4 h. Les échantillons ont ensuite été rincés abondamment avec de l'eau et de l'éthanol, séchés à l'air médical et conservés sous vide jusqu'au dépôt de l'hydrogel.
3.3.4. Dépôt de l'hydrogel sur les aiguilles
Des tubes de titane (Goodfellow, Huntington, Angleterre) de diamètre externe 0.51, 1.05 et 1.6 mm (pureté 99.6%, diamètre interne de 0.35, 0.75 et 1.2 mm respectivement) ont été découpés en morceaux de 1 cm de longueur. Ces tubes ont été choisis pour leur correspondance avec des aiguilles de 16, 19 et 25 G (Tableau 1). Les aiguilles ont été nettoyées et traitées avec un phosphate acrylate tel que décrit précédemment. Elles ont ensuite été trempées à température ambiante dans le précurseur d'hydrogel en utilisant un système de trempage-retrait fabriqué dans le laboratoire (Xslide, # XN10-0060-M01-71, Velmex Inc,
Bloomfield, NY, USA). Dans un premier temps, des essais pour déterminer la vitesse optimale de retrait ont été effectués. Trois vitesses de retrait ont été essayées : 0.1 mm s-1, 1 mm s-1 et 10 mm s-1. Les substrats ont été observés au microscope optique et le dépôt le plus homogène était obtenu pour une vitesse de retrait de 1 mm s-1. Les substrats ont donc été trempés à une vitesse de 1 mm s-1 et laissés 4 s en immersion avant d'être retirés à une vitesse de 1 mm s-1. Après une pause de 1 s, quatre autres cycles ont été réalisés avec les mêmes paramètres pour un total de cinq trempages-retraits afin d'homogénéiser le dépôt à la surface des aiguilles. Ensuite les échantillons recouverts d'hydrogels ont été placés 15 min dans une chambre à UV et irradiés ( = 365nm, 5 mW cm-2) pour réticuler. Les aiguilles sont ensuite stockées dans l'eau pour conserver l'hydrogel en état d'hydratation.
Mesure de l'épaisseur de l’hydrogel sur les aiguilles
Une corrélation entre la viscosité du précurseur d'hydrogel (modulée par le pourcentage massique de silice fumée dans la solution comme il sera expliqué dans la section 6.1.4) et l'épaisseur des dépôts sur les aiguilles a été réalisée. Pour évaluer l'épaisseur de l'hydrogel, les aiguilles ont été visualisées avec un microscope à contraste de phase (Axiophot Microscope, Zeiss Germany, grossissement 20X avec un objectif Nikon, Japon). La calibration de l'échelle a été faite avec un hémocytomètre standard et l'épaisseur a été évaluée par superposition des images de l'hémocytomètre et des aiguilles avec Photoshop CS6.
Visualisation des aiguilles en IRM
L'augmentation de contraste des hydrogels paramagnétiques à la surface des aiguilles a été visualisée en IRM avec un appareil de 1 T (M2M, Aspect Imaging, Netanya, Israel). Les aiguilles ont été placées dans des tubes de 0.2 mL remplis d'eau qui ont été ensuite insérés dans une bobine de 60 mm et scannés en utilisant une séquence pondérée en T1 avec les paramètres résumés dans le Tableau 10 en fonction de l'image
de la Figure 86 de la section 6.2.4.
Tableau 10. Paramètres des séquences IRM utilisées pour les images de la Figure 86
Figure Séquences [ms] TE [ms] TR
Tranches/
Matrice Résolution [µm] Excitations d'acquisition Temps [min:s] Intertranches [mm/mm] Figure 86 a) Écho de spin 14.4 488.8 0.9/0.1 400 x 400 175 1 03:16 b) Écho de spin 10.6 400 0.9/0.1 128 x 128 547 1 00:51 c) Écho de spin 11.2 400 0.9/0.1 200 x 200 350 1 01:20 d) Écho de spin 14.4 488.8 0.9/0.1 400 x 400 175 1 03:16 e) Gradient d'écho 2.1 16.9 1/0 128 x 128 703 1 01:00 f) Gradient d'écho 2.6 16.9 1/0 200 x 200 450 1 01:25 g) Gradient d'écho 3.8 16.9 1/0 400 x 400 225 1 02:36
L'intensité du signal a été mesurée en utilisant Image J. Des ROI ("regions of interest") ont été sélectionnées dans l'hydrogel et dans l'eau. On intègre les niveaux de gris sur les ROI, avec le logiciel, pour quantifier l’augmentation du signal puis on normalise avec l’eau pour obtenir un pourcentage d'augmentation du signal (Équation 34).
2
Équation 34
Avec l'intensité de signal dans la ROI de l'hydrogel et l'intensité de signal dans la ROI de l'eau.