3. Méthodologie de synthèse et de caractérisation des produits 58
3.4. Billes d'alginate encapsulant des MSN-DTPA-Gd 70
La préparation des nanoparticules fonctionnalisées avec le DTPA est réalisée telle que décrite dans la section 3.1. L'étape de chélation du gadolinium a été légèrement modifiée, en raison de la nécessité d'obtenir le produit final dans un milieu biologique simulé plutôt que dans de l'eau. Le produit MSN-DTPA obtenu est mélangé à une solution de gadolinium acétate (100 mM, 10 mg mL-1, 1 h sous agitation, à température ambiante). Après agitation, le produit est mis en suspension en alternant 30 min de vortex et 30 min dans un bain à ultrasons, trois fois. Une dialyse dans l'eau, d’une durée allant de 16 à 24 h, est ensuite réalisée pour éliminer l'excès d'ions Gd3+ dans la suspension. Le produit est récupéré par centrifugation (15 min, 24000 g) et remis en suspension dans le milieu désiré (PBS + 10 % FBS pour l'expérience sans les cellules, DMEM + 10 % FBS + 1 % PS pour celle avec les cellules), à une concentration de 50 mg mL-1. Une remise en suspension est réalisée comme précédemment, (30 min vortex, 30 min bain à ultrasons, 3 fois) puis la solution est centrifugée (5 min, 500 g) pour éliminer les particules instables. Le surnageant est conservé sous l'appellation MSN-DTPA-Gd.
Dans le cas de l'expérience avec cellules, le produit a été stérilisé aux rayons gamma, un procédé utilisé en industrie alimentaire pour sa capacité à détruire les organismes vivants sans endommager la structure des produits. Les MSN-DTPA-Gd ont été irradiés 1 h pour une dose totale de 25 kGy ±10% (Nordion, Gamma Centre of Excellence, Laval, Canada). La stabilité colloïdale de la suspension de MSN-DTPA-Gd ainsi que le rayon hydrodynamique des nanoparticules sont confirmés par DLS (Dynamic Light Scattering) grâce à un appareil Malvern Nano S Zetasizer (Malvern Instruments, Worcestershire, Angleterre). Le laser (He-NE) a une longueur d'onde de 633 nm et l'angle de dispersion est de 173°. La température pour les mesures est de 25 °C. Après un temps d'équilibre de 180 s, trois mesures sont effectuées. Seules les mesures avec un critère de qualité "bon" sont acceptées. Les valeurs des solvants utilisées sont un indice de réfraction de 1.334 et 1.450
ainsi qu'une viscosité de 1.050 cP et 1.054 cP respectivement pour le PBS et le DMEM. L'indice de réfraction des nanoparticules de silice mésoporeuses a été fixé à 1.45.
Les relaxations longitudinale et transverse (T1 et T2) sont mesurées avec un relaxomètre Bruker
Minispec 60 mq, 60 Hz (1.41 T) à 25 °C, en déposant 300 µL dans des tubes de RMN de 7 mm. Pour les mesures de T1, une séquence standard d'inversion-recouvrement a été utilisée avec 15 temps d'attente
différents tandis que pour les mesures de T2, une séquence standard Carr-Purcell-Meibom-Gill a été utilisée
avec au moins 12 échos.
3.4.2. Encapsulation des MSN-DTPA-Gd dans des billes d'alginate
La méthodologie de préparation des billes d’alginate a été mise au point dans le laboratoire du Pr Hoesli à McGill. Les solutions d'alginate sont préalablement préparées en dissolvant un sel de sodium d'acide alginique (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA) dans une solution tampon (HEPES 10 mM, NaCl 170 mM, pH 7.4) puis stérilisées à l'autoclave. La préparation des billes d'alginate par émulsion et gélation interne a déjà été décrite dans la littérature.[209]
3.4.2.1. Expérience sans cellules
Encapsulation
Cette procédure a été développée au laboratoire du Dr Hoesli et appliquée par Ryan Sutcliffe (étudiant du Dr Hoesli) dans ce projet. Dans une première étape, 9.9 mL d'alginate sont mélangés à 0.55 mL de CaCO3 (Light Powder, J.T. Baker, Canada), dans un ratio volumique de 18:1, et à 1.1 mL de DMEM pour les contrôles ou 0.22 mL de DMEM et 0.88 mL de la suspension MSN-DTPA-Gd pour les billes avec nanoparticules. Ce mélange est transféré dans le réacteur préalablement rempli de 20 mL d'huile minérale légère. La vitesse d'agitation est réglée à 398 rpm pour les billes à 2 % d'alginate et à 662 rpm pour les billes à 7.5 % d'alginate. Ces valeurs ont été prédéterminées au cours d’expériences antérieures dans le groupe du Dr Hoesli. Après 12 min d'agitation pendant lesquelles les billes sont formées par émulsion, la gélification des billes se fait en libérant les ions Ca2+ par ajout dans le réacteur de 40 µL d'acide acétique glacial (Fisher, Canada) dans 10 mL d'huile minérale légère. Le mécanisme de gélification est représenté en Figure 47a.
Figure 47. a) Molécule d'alginate et gélification après ajout des ions Ca2+ et b) schéma des phases présentes après
centrifugation du mélange dans le réacteur.
Après 8 min d'agitation, le mélange est neutralisé par l'ajout de 36 mL de solution saline d'HEPES et 4 mL de DMEM. L'agitation est maintenue 1 min puis le réacteur est arrêté et 20 mL de DMEM sont ajoutés. Le mélange est transféré pour être centrifugé 3 min à 630 g. Il apparaît trois phases distinctes dans les tubes, tel que schématisé dans la Figure 47b.
La phase organique et la phase aqueuse sont retirées par aspiration puis les billes sont lavées deux fois dans du DMEM (centrifugation 3 min à 630 g). Un filtre nylon de 40 µm (Falcon® 40µm Cell Strainer, Corning, Corning, NY, USA) permet ensuite de récupérer les billes. Ces dernières sont alors ajoutées dans le milieu souhaité (soit HEPES, soit le DMEM) dans un ratio volumique 1:5, c’est-à-dire que dans 20 mL du milieu, les billes sont ajoutées jusqu'à ce que le volume monte à 25 mL (mesure par déplacement volumique). Les différents lots préparés sont résumés dans le Tableau 11.
Tableau 11. Description des lots préparés pour l'expérience d'encapsulation des MSN‐DTPA‐Gd dans des billes d'alginate sans cellule. La terminaison M et H dans le nom de l'échantillon correspond au milieu dans lequel est conservé l'échantillon.
Nom d'échantillon Pourcentage d'alginate [%] MSN-DTPA-Gd Milieu
2%-Ctrl-M 2 Non DMEM 2%-Ctrl-H 2 Non HEPES 2%-MSN-M 2 Oui DMEM 2%-MSN-H 2 Oui HEPES 7.5%-Ctrl-M 7.5 Non DMEM 7.5%-Ctrl-H 7.5 Non HEPES 7.5%-MSN-M 7.5 Oui DMEM 7.5%-MSN-H 7.5 Oui HEPES
Caractérisation des billes
Les billes sont observées au microscope optique (Motic AE21, Motic Instrument Inc., Richmond, BC, Canada). Elles sont ensuite photographiées et une distribution de taille est réalisée avec le logiciel CellProfiler. La distribution de taille est effectuée sur 3 images avec 500 à 2500 billes par image. Cette mesure a été réalisée par Karen Markwick du laboratoire du Dr Hoesli.
Visualisation des billes en IRM
Pour visualiser les billes d'alginate en IRM, elles ont préalablement été transférées dans une plaque de 96 puits. Les tubes ont été agités manuellement, puis 200 µL de chaque lot ont été pipetés avec un embout coupé pour avoir un diamètre de sortie d'au moins 4 mm (afin de ne pas endommager les billes). Les billes ont été analysées en IRM (voir description de l’appareil dans les chapitres précédents). La plaque a été insérée dans une bobine radio fréquence adaptée pour les plaques de 96 puits et scannée en utilisant une séquence écho de spin pondérée en T1, avec les paramètres suivants : TE de 11.2 ms, matrice de 200x200, épaisseur de
tranche de 1.5 mm, champ de vue de 70 mm et 3 excitations. Trois temps TR différents ont été utilisés : 400 ms pour une durée d'acquisition de 4 min, 700 ms pour une durée d'acquisition de 7 min et 1000 ms pour une durée d'acquisition de 10 min. Aucun contrôle de la température n’a été effectué, les plaques conservées à une température de 4°C sont sorties 15 min avant l’analyse.
Les images ont été analysées avec ImageJ (version 1.47v), pour calculer l'augmentation de contraste. Pour ce faire, des ROI (Region of Interest = zones d’intérêt) ont été dessinées dans chaque puit. Lorsque les puits contenaient des billes d’alginate, deux ROI différentes ont été dessinées, une dans le bas du puit et une dans le haut, correspondant respectivement aux billes et au surnageant (Figure 48). En effet, de par leur taille, les billes ne restent pas en suspension. Pour les mesures d’augmentation de contraste, ce sont les ROI du bas du puit (partie contenant les billes) qui ont été utilisées. Les ratios déterminant s’il y a eu relargage de gadolinium au cours du temps sont calculés en utilisant le rapport du signal dans la ROI du bas du puit sur celle du haut du puit.
Figure 48. Exemple de ROI dans un puit contenant des billes d'alginate avec MSN‐DTPA‐Gd (2‐Gd‐M). En rouge, les rectangles définissent la zone utilisée pour analyser les tons de gris et extraire la valeur du signal au sein du rectangle. C'est cette valeur qui sert ensuite à faire les calculs d’augmentation du signal. A gauche, la ROI dans le bas du puit, à droite la ROI dans le haut de ce même puit.
L’applet « ROI Manager » a été utilisée afin de collecter toutes les zones d’intérêt et de faire les mesures du signal. Les ROI sont placées sur une zone représentative du produit, avec une surface minimale de vingt pixels et sous forme rectangulaire. Le calcul de l’augmentation du contraste se fait en utilisant l’équation présentée précédemment (Équation 34 dans la section 3.3.4).
3.4.2.2. Expérience avec cellules
Encapsulation
Cette procédure a été développée au laboratoire du Dr Hoesli et appliquée par Sary Sarkis (étudiant du Dr Hoesli) dans ce projet. Dans une première étape, 8.8 mL d'alginate 2% sont mélangés à 0.55 mL de CaCO3 dans un ratio volumique de 18:1 et à 1.1 mL de DMEM pour les contrôles ou 1.1 mL de la suspension MSN-DTPA-Gd pour les billes avec nanoparticules. Ce mélange est transféré dans le réacteur préalablement rempli de 20 mL d'huile minérale légère. Après 12 min d'agitation à 360 rpm, 40.5 µL d'acide acétique glacial, dans 11 mL d'huile minérale légère, sont ajoutés. Après 8 min d'agitation, le mélange est neutralisé par l'ajout de 40 mL de solution saline d'HEPES. L'agitation est maintenue 1 min puis le réacteur est arrêté et le mélange est transféré pour être centrifugé 3 min à 630 g. La phase organique et la phase aqueuse sont retirées par aspiration puis les billes sont lavées deux fois dans du DMEM (centrifugation 3 min à 630 g). Un filtre nylon de 40 µm permet ensuite de récupérer les billes. Ces dernières sont alors ajoutées au DMEM dans un ratio volumique 1:10.
Visualisation des billes en IRM
Pour chaque lot de billes (contrôles et avec nanoparticules), 200 µL sont pipetés dans une plaque de 96 puits, tel que décrit précédemment. Dans la plaque, 200 µL d'eau, 200 µL d'une solution de MSN-DTPA-Gd diluée 1:10.5 comme dans les billes et 200 µL d'une solution Gd3+ 1 mM ont aussi été déposés. La plaque a été insérée dans une bobine radio fréquence adaptée pour les plaques de 96 puits et scannée en utilisant une séquence écho de spin pondérée en T1, avec les paramètres : TR de 400 ms,
TE de 13.3 ms, matrice de 200x200, épaisseur de tranche de 0.5 mm, champ de vue de 70 mm et 3 excitations, pour une durée d'acquisition de 4 min. Les images ont été analysées avec ImageJ (version 1.47v) pour calculer l'augmentation de contraste. La plaque a été imagée à 24h, 48h et 72h, ensuite une autre plaque a été réalisée et imagée, sur le même modèle, après 7 jours puis encore une autre après 14 jours. Cette plaque a été conservée à 4 °C et imagée un mois et deux mois après le début de l'expérience.