7. Hydrogels paramagnétiques pour l’encapsulation d’ilots de Langerhans et le suivi par IRM de la thérapie
7.3. Conclusion 130
L'encapsulation de cellules productrices d'insuline dans des billes d'alginate représente un espoir pour le traitement du diabète de type 1. Le traçage de ces billes, après leur implantation, peut être effectué par une imagerie du corps en IRM, si les billes présentent un rehaussement de contraste par rapport au milieu environnant. Des nanoparticules de silice mésoporeuses fonctionnalisées avec un agent de contraste paramagnétique, le gadolinium (MSN-DTPA-Gd), ont donc été encapsulées dans des billes d'alginate.
Les billes encapsulant des MSN-DTPA-Gd présentent une augmentation de contraste moyenne de 99 ± 12 % (moyenne sur les billes d'alginate 2 % et 7.5 % dispersées dans du DMEM et de l'HEPES), pour des temps d'acquisition d'image pouvant être réduits jusqu'à 4 min (pour le corps entier de la souris). Il est donc possible, par un scan rapide, de visualiser la répartition des billes d'alginate après implantation dans le corps. Une analyse IRM réalisée 5 mois après la préparation des billes d'alginate encapsulant les nanoparticules, montre qu'il n'y a pas de relargage du complexe de gadolinium, ce qui permet un suivi à long terme après l'implantation.
Un suivi IRM pendant deux mois après encapsulation des cellules et des nanoparticules dans les mêmes billes d'alginate a permis de constater que la présence de cellules ne modifiait pas le comportement observé dans l'expérience sans cellules. La présence de cellules ne modifie pas le contraste obtenu entre les billes contenant des MSN-DTPA-Gd et l'eau et ne provoque pas de relargage du gadolinium dans le milieu environnant.
Les résultats des deux expériences d'encapsulation des MSN-DTPA-Gd dans des billes d'alginate démontrent la possibilité de visualiser ces billes pour un suivi à long terme après injection dans le corps. Il est ainsi possible de déterminer la répartition des billes après implantation dans la cavité péritonéale.
Conclusion
Ce travail a permis le développement d'hydrogels encapsulant des nanoparticules fonctionnalisées avec un agent de contraste paramagnétique, permettant d’en faciliter leur visualisation en IRM. Deux applications biomédicales, utilisant ces produits, ont été développées et les résultats obtenus démontrent que ces hydrogels paramagnétiques apparaissent clairement contrastés par rapport à leur environnement lors d'une visualisation en IRM.
Développement de nanoparticules paramagnétiques :
La première étape du projet a consisté à développer des nanoparticules de silice mésoporeuses (MSN) fonctionnalisées avec un agent de contraste paramagnétique, un chélate de gadolinium (MSN-DTPA-Gd). La procédure de synthèse des nanoparticules est inspirée des travaux de Kim[195] et permet d'obtenir des nanoparticules de type MCM-48 sphériques entre 100 et 200 nm de diamètre. Des analyses de physisorption d'azote montrent une distribution de taille de pore étroite centrée autour de 3 nm, un volume de pore de 1 cm3 g-1 et une surface spécifique d'environ 1200 m² g-1. La fonctionnalisation des MSN est faite par greffage post-synthèse. Le pourcentage massique de DPTA greffé en surface est vérifié par ATG et comparé à l'étude de Bouchoucha et al.[18] sur les quantités optimales pour greffer un maximum de chélate sans perdre les
propriétés porosimétriques des nanoparticules. La conservation de ces propriétés est aussi contrôlée par physisorption d'azote.
Le gadolinium est ensuite chélaté. Les propriétés relaxométriques sont obtenues en mesurant les valeurs de T1 et T2 pour différentes concentrations de gadolinium. Les relaxivités obtenues (r1 = 26 mM-1 s-1 et r2 = 38 mM-1 s-1) donnent un rapport r2/r1 de 1.46, similaire à ce qui a été obtenu par Bouchoucha et al.[18] Ces excellentes propriétés relaxométriques démontrent donc que ces nanoparticules sont de bonnes candidates pour un piégeage dans un hydrogel afin d'en rehausser le contraste. Enfin, pour explorer les possibilités de leur utilisation en milieu biologique, une étude de viabilité cellulaire a été effectuée. Des cellules de cancer de la prostate (PC3) ont été mises en contact avec des MSN-DTPA-Gd suspendues dans du milieu de culture (de 0.1 mg mL-1 à 1 mg mL-1). Sur 72 h, la viabilité reste de 100 % par rapport au contrôle sans nanoparticules. Ces études montrent bien que les nanoparticules MSN-DTPA-Gd ne présentent pas de signe de toxicité à court terme pour les cellules qui sont en contact avec elles.
Évolution des MSN après traitement thermique :
Dans un premier temps, une étude du comportement des MSN disposées en couches minces et ayant subi une procédure de frittage, a été effectuée. Cette étape a permis d’explorer la possibilité de constituer des couches de MSN sans avoir recours à un polymère d’encapsulation. En fait, cette étude nous a permis de
réaliser la difficulté de constituer des revêtements uniquement faits de silice afin de recouvrir des dispositifs médicaux avec une couche suffisamment épaisse et cohérente pour qu’elle soit visible en IRM. Des substrats de silicium ont été trempés dans une suspension aqueuse de MSN et retirés à différentes vitesses. Des vitesses très lentes sont nécessaires pour obtenir des couches uniformes et compactes. Une vitesse de retrait de 0.01 mm s-1 a permis l'auto-assemblage des MSN en une monocouche structurée sans utiliser de polymères ou de surfactants qui pourraient interférer dans le procédé de fixation par frittage.
L'influence du traitement thermique sur les nanoparticules a été étudiée pour des températures de 500 °C, 600 °C, 700 °C, 800 °C et 900 °C. La visualisation des couches au MEB permet de constater que la monocouche structurée est conservée mais que les particules se rassemblent en laissant apparaître des espaces distincts entre les groupes de particules. Des analyses par physisorption d'azote et DRX ont été réalisées pour évaluer l'évolution de la taille des pores, de la densité, de la structure poreuse et des propriétés surfaciques des nanoparticules. Après un réarrangement de la silice vers 600 °C, la taille des particules et le volume de pore diminuent drastiquement au-delà de 700 °C, conduisant à une densification des nanoparticules. À 900 °C, des ponts entre les MSN sont observés par MEB, preuve que le frittage a lié les particules les unes aux autres ainsi qu'au substrat. Cependant les propriétés porosimétriques de particules sont perdues dans le processus. Afin de conserver le volume des pores, la surface spécifique et la structure du réseau poreux, le frittage de nanoparticules de type MCM-48 doit être réalisé à une température inférieure à 700 °C. Ces travaux ont fait l'objet d'une publication.[94] En effet, des couches minces de nanoparticules de silice présentent un intérêt dans le domaine de l'optique,[36] en particulier pour la réalisation de recouvrements antireflets.[40]
Revêtements paramagnétiques :
L'IRM est une méthode d'imagerie médicale particulièrement sensible avec une haute résolution. Elle est donc fréquemment utilisée dans la chirurgie interventionnelle. Malheureusement, le matériel utilisé pendant les procédures n'est pas toujours clairement visible par rapport à son environnement dans le corps. Le dépôt d'une couche paramagnétique à la surface de ces dispositifs pourrait permettre une augmentation du contraste et donc une meilleure visibilité en IRM. Cependant l'étude précédente a démontré la complexité de réaliser des dépôts solidement accrochés à un substrat de silicium sans utilisation de matériaux polymères. Pour constituer des couches paramagnétiques, les MSN-DTPA-Gd ont donc été encapsulées dans un hydrogel de poly (éthylène glycol) tétra-acrylate. Une étude NMRD a permis d'évaluer les propriétés de relaxivité (r1) sur une large gamme de champs magnétiques. Bien que la relaxivité de l'hydrogel soit 1.8 fois inférieure à celle de l’agent de contraste utilisé comme précurseur (Gd-DTPA), r1 est suffisamment élevé, aux champs magnétiques cliniques, pour donner lieu à un rehaussement de contraste significatif en IRM. L'efficacité de l'hydrogel à piéger les MSN-DTPA-Gd a été évaluée par IRM sur une période de deux mois. Aucun relargage de gadolinium hors
du réseau réticulé n'a été observé. L'hydrogel paramagnétique a été visualisé en utilisant de petits volumes de produit, de l’ordre de la taille des voxels d’IRM (0.25 µL).
Une fois les propriétés de l'hydrogel confirmées, des substrats de titane ont été préparés pour pouvoir ensuite déposer l'hydrogel par trempage-retrait sur des objets se rapportant géométriquement à la forme et aux matériaux des aiguilles de biopsie. Le titane a été nettoyé avec une solution acide puis basique afin de retirer la couche de contaminants puis fonctionnalisé avec un phosphate acrylate. La confirmation de la modification de la surface du titane a été effectuée par XPS (survol et haute résolution) ainsi que par FTIR. Les analyses confirment que le phosphate acrylate s'est bien chimiquement greffé par liaison Ti–O–P au substrat. Une fois les substrats greffés avec des molécules d’acrylate, une couche de précurseur a été déposée en surface par trempage-retrait et réticulée en hydrogel par irradiation UV. Le signal étant optimal lorsque l'épaisseur du dépôt correspond à la taille d'un voxel (environ cent microns), l'épaisseur a été optimisée en modulant le pourcentage massique d'un agent gélifiant (la silice fumée) dans le précurseur. Une étude de la viscosité des solutions a été effectuée puis une visualisation au microscope optique des couches d'hydrogel sur des tubes de titane a permis de corréler l'épaisseur du dépôt avec le pourcentage massique de silice fumée.
Des tubes de titane de trois diamètres différents, simulant les aiguilles de biopsies, ont été trempés dans un précurseur contenant le polymère, les MSN-DTPA-Gd et 11.5 wt% de silice fumée. Des séquences IRM "rapides" (entre 1 et 3 min) ont été utilisées pour visualiser ces aiguilles. Les paramètres de trempage-retrait doivent être modulés pour chaque diamètre d'aiguille à cause de la modification du rayon de courbure. Pour des aiguilles de 1.05 mm, l'hydrogel présente une augmentation de contraste de 178 % par rapport à l'eau. Ces résultats sont reproductibles et confirment la possibilité de recouvrir des aiguilles de biopsie d'un hydrogel paramagnétique pour en faciliter la localisation sous IRM.
Visualisation de billes d'alginate en IRM :
Afin de permettre le traçage de billes d'alginate après implantation dans le corps, des MSN-DTPA-Gd ont été encapsulées à l'intérieur, lors du procédé de synthèse par émulsion. Des images IRM ont été réalisées pour évaluer l'efficacité des MSN-DTPA-Gd à rehausser le signal des billes. Une augmentation de contraste de 113 % entre les billes avec nanoparticules et sans nanoparticules a été obtenue pour une séquence IRM pondérée en T1 (4 min.). Les échantillons ont été visualisés à nouveau 5 mois après leur synthèse et aucun
relargage de gadolinium dans le milieu environnant n'a été constaté. Il est donc possible de suivre des billes d'alginate dans le corps et ce sur le long terme sans perdre de signal.
Ces billes d'alginate sont destinées à servir de barrière immuno-isolante dans le cadre du traitement du diabète de type 1 par implantation de cellules productrices d'insuline. Les nanoparticules encapsulées seront donc en présence de cellules. Pour vérifier l'influence de ces dernières, une autre étude a été réalisée avec des
billes d'alginate contenant des cellules et des particules MSN-DTPA-Gd. Ces dernières montrent une augmentation de contraste de 69 % par rapport aux billes d'alginate sans nanoparticules. La présence de cellules n'influe pas sur les performances relaxométriques des nanoparticules. Aucune dégradation conduisant au relargage du gadolinium n'a été observée sur deux mois. L'encapsulation de MSN-DTPA-Gd dans des billes d'alginate en permet donc le suivi après implantation dans le corps. Aucun relargage de gadolinium, qui conduirait à une perte de signal dans les particules, n'a été observé.
Perspectives :
Ce travail de thèse a présenté des hydrogels paramagnétiques avec un rehaussement de contraste en IRM. C'est un projet alliant la physique, la chimie et la biologie et ouvrant donc de nombreuses possibilités. Les résultats obtenus ont démontré la pertinence de l'utilisation d'agents de contraste greffés sur des nanoparticules de silice pour rehausser le signal d'hydrogels et permettre à ces dernier d'être visibles en IRM.
De manière globale, il serait intéressant d'étendre l'encapsulation des MSN-DTPA-Gd aux autres polymères biocompatibles couramment utilisés dans le domaine du biomédical : chitosane, collagène, acide hyaluronique, PVA, PHEMA… On trouve dans la littérature l'insertion d'agents de contraste dans des hydrogels réalisés avec de nombreux polymères[132, 234-236] mais ces derniers sont souvent liés chimiquement au polymère pour éviter un relargage. L'utilisation de nanoparticules, plus grosses, permet de s'affranchir de la nécessité d'une étape chimique incluant des fonctions qui peuvent se lier entre elles. La preuve de concept a été réalisée avec des hydrogels de PEG et d'alginate mais ces deux polymères ne représentent qu'une fraction des polymères utilisés en biomédical. L'encapsulation des nanoparticules, ainsi qu'une étude de leurs propriétés relaxométriques dans des hydrogels avec différents polymères, permettrait de généraliser ce travail et de déterminer les meilleurs polymères pour obtenir des hydrogels à fort rehaussement de contraste.
La visualisation des billes d'alginate, lorsqu'elles encapsulent les nanoparticules, ouvre la porte à cette méthode, pour localiser les hydrogels injectables, que ce soit dans le cadre de l'élution de médicaments ou pour l'ingénierie tissulaire. Il sera important de bien étudier le comportement des nanoparticules en fonction de la dégradation du polymère. S'il s'agit d'un hydrogel à dégradation rapide, une étude confirmant la non toxicité des nanoparticules suivant leur emplacement est importante. S'il s'agit d'un hydrogel implanté à long terme, une vérification de la dégradation des nanoparticules au cours des années est nécessaire. Des études de la dégradation des MSN en milieu biologique ont déjà été réalisées[251, 252] mais jamais après encapsulation dans un hydrogel.
L'utilisation de couches d'hydrogel en surface de dispositifs médicaux, pour en favoriser la visualisation sous IRM, doit conduire à une étude tribologique. La solidité du dépôt doit être vérifiée lorsqu'il est soumis aux contraintes d'une insertion dans le corps d'un patient. Pour cela, des tests ex-vivo, avec des substituts de tissus
ou des milieux balistiques, permettraient d'évaluer la nécessité de modifier le dépôt en fonction des contraintes appliquées. Pour éviter que la couche d'hydrogel ne soit arrachée au cours de la procédure chirurgicale, il est possible de creuser des sillons dans les dispositifs médicaux utilisés pendant les interventions sous IRM. Cette option permettrait de placer l'hydrogel paramagnétique dans l'instrument médical plutôt qu'en surface et donc de préserver l'hydrogel de la friction du milieu environnant. Cette option n'est cependant applicable que sur des substrats suffisamment épais pour être creusés.
L'imagerie multimodale tire parti des points forts des différentes techniques d'imagerie pour fournir une image plus complète de l'anatomie.[253] Le développement de molécules et nanoparticules pouvant être visualisées dans plusieurs systèmes d'imagerie est en plein essor. Intégrer ces dernières dans les hydrogels pourrait permettre d'extraire plus d'informations, comme par exemple en couplant l'IRM qui fournit des informations structurelles et la tomographie par émission de positron (PET) qui apporte des informations quantitatives, pour un suivi de dégradation.
L'utilisation de nanoparticules de type MCM-48 fonctionnalisées avec un agent de contraste offre un système poreux et paramagnétique, à effet de contraste en IRM. Cette porosité peut aussi être utilisée pour l'élution de médicaments. Les travaux de Bouchoucha et al.[18] ont démontré l'efficacité des MCM-48 pour relarguer une molécule anti-cancéreuse. Les hydrogels sont déjà utilisés pour l'élution de médicaments[254] mais de nombreux défis dus à la nature organique des polymères, à leur perméabilité ou encore à leur cinétique de relargage[255] compliquent le piégeage de molécules médicamenteuses et leur élution. Le recours à l'encapsulation de nanoparticules de silice mésoporeuses, déjà très utilisées pour l'élution de médicaments,[29, 256, 257] pourrait être une alternative permettant de s'affranchir de ces défis tout en pouvant visualiser l'hydrogel par IRM.
Annexe A : Caractérisation des produits synthétisés
dans cette thèse
Cette annexe regroupe uniquement les données de caractérisation des lots MSN et MSN-DTPA-Gd synthétisés et utilisés dans cette thèse. Les techniques de caractérisation sont décrites au Chapitre 1 et en Annexe C; l'explication et l'exploitation de ces données sont décrites dans la section 4.1.
Lot CMF (Couches Minces Frittage)
Ce lot est utilisé dans le chapitre 1. Il s'agit de MCM-48 non fonctionnalisées.
Diffraction des Rayons X
Figure 100. Diffractogramme DRX du lot CMF.
Le diffractogramme correspond bien à la structure Ia3d des MCM-48.
Microscopie Électronique en Transmission
Figure 101. Images MET du lot CMF (a et b) et distribution de taille des nanoparticules (c).
Les MCM-48 sont bien sphériques, avec une distribution de taille étroite et centrée à 150 nm.
2 [°] 2 3 4 5 6 7 8 Inte ns ity [a .u.] 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 (211) (220) (321)(400)(420) (332) 2 [°] (hkl) d [Å] 2.62 (211) 33.72 3.01 (220) 29.32 4.03 (321) 21.95 4.32 (400) 20.45 4.82 (420) 18.34 5.04 (332) 17.53
Physisorption d'azote
Figure 102. Isothermes de physisorption du lot CMF (a) et distribution de taille des pores (b).
Les MCM-48 présentent une surface spécifique de 1268 m2 g-1, un volume des pores de 1.01 cm3 g-1 et un diamètre moyen des pores de 3.5 nm.
Lot HYD (HYDrogel)
Diffraction des Rayons X
Figure 103. Diffractogramme DRX du lot HYD.
Le diffractogramme correspond bien à la structure Ia3d des MCM-48.
Relative pressure P/P0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Ads o rbed v ol um e [c m 3 g -1] 0 200 400 600 800 1000 1200 Adsorption branch Desorption branch Pore width [nm] 2 3 4 5 6 dV (d) [cm 3 Å -1 g -1] 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 a) b) 2 3 4 5 6 7 8 In te ns ity [a .u .] 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
Microscopie Électronique en Transmission
Figure 104. Distribution de taille des nanoparticules (a) et image MET du lot HYD (b).
Les MCM-48 sont bien sphériques, avec une distribution de taille étroite et centrée à 150 nm.
Physisorption d'azote
Figure 105. Isothermes de physisorption d’azote (‐196 °C) du lot HYD avant fonctionnalisation (a) et après fonctionnalisation avec le DTPA (b).
Les mesures de physisorption sont faites sur les MSN pures (a) et les MSN après fonctionnalisation avec le DTPA (b). Pour les MSN, la surface spécifique est de 1191 m² g-1, le volume des pores est de 0.99 cm3 g-1 et le diamètre moyen des pores est de 3.53 nm. Pour les MSN-DTPA, la surface spécifique est de 1058 m² g-1, le volume des pores est de 0.85 cm3 g-1 et le diamètre moyen des pores est de 3.41 nm. La faible évolution du volume poreux et du diamètre des pores indiquent qu'il n'y a qu’une faible quantité de DTPA greffé dans le système poreux des MSN et que le DTPA s'est donc majoritairement greffé en surface extérieure.
Relative pressure P/P0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Ad so rb e d vol um e [c m 3 g -1] 0 200 400 600 800 1000 1200 a) b) Relative pressure P/P0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Adsor bed v olu m e [cm 3 g -1] 0 200 400 600 800 1000 1200
Analyse Thermogravimétrique
Figure 106. Graphe d'ATG du lot HYD après fonctionnalisation.
La perte de masse, entre 150 °C et 500 °C (correspondant à la dégradation du DTPA), est de 7 %. Cela corrobore les valeurs obtenues avec la physisorption après fonctionnalisation et correspond aux quantités greffées dans l'article sur l'optimisation de la fonctionnalisation par Bouchoucha et al.[18]
Temps de relaxation
Figure 107. Taux de relaxation longitudinale (1/T1) et transverse (1/T2) du lot HYD (a) et le signal relatif estimé pour un TR
de 400 ms et un TE de 10 ms (b), tous les deux en fonction de la concentration en Gd3+.
La relaxivité longitudinale est de 26 mM-1 s-1 et la relaxivité transverse est de 28 mM-1 s-1. Le rapport r2/r1 est donc de 1.46, ce qui correspond aux valeurs déjà publiées dans la littérature.[18] Les temps T1 et T2 pour la solution non diluée étaient de 19.18 ± 0.05 ms et 13.210 ± 0.003 ms respectivement.
Temperature [°C] 0 100 200 300 400 500 600 700 M ass los s [% ] 80 85 90 95 100 Temperature [°C] 0 100 200 300 400 500 600 700 Ma ss lo ss [% ] 0 20 40 60 80 100 Gadolinium concentration [mM] 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 R e lat iv e e st im at ed sig nal 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Gadolinium concentration [mM] 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 1/ T [si -1] 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1/T1 1/T2 38 x - 2.16 R2 = 0.996 26 x - 1.14 R2 = 0.996 a) b)
Quantification de la concentration en gadolinium
La concentration en gadolinium a été mesurée par ICP-MS. Elle est de 2.0 mM dans la solution non diluée. Lors de la réalisation des hydrogels, cette solution a été diluée jusqu'à une concentration de 0.4 mM, pour obtenir un signal optimal.
Lot BAL (Billes ALginate)
Diffraction des Rayons X
Figure 108. Diffractogramme DRX du lot BAL.
Le diffractogramme correspond bien à la structure Ia3d des MCM-48.
Microscopie Électronique en Transmission
Figure 109. Image MET du lot HYD et distribution de taille des nanoparticules.
Les MCM-48 sont bien sphériques, avec une distribution de taille étroite et centrée sur 150 nm. 2 [°] 2 3 4 5 6 7 8 In ten si ty [ a .u .] 0 2000 4000 6000 8000
Physisorption d'azote
Figure 110. Isothermes de physisorption d’azote (‐196 °C) du lot BAL avant fonctionnalisation (a) et après fonctionnalisation avec le DTPA (b).
Les mesures de physisorption sont faites sur les MSN pures (a) et les MSN après fonctionnalisation avec le DTPA (b). Pour les MSN, la surface spécifique est de 1223.9 m² g-1, le volume des pores est de 0.94 cm3 g-1 et le diamètre moyen des pores est de 3.5 nm. Pour les MSN-DTPA, la surface spécifique est de 1106.8 m² g-1, le volume des pores est de 0.75 cm3 g-1 et le diamètre moyen des pores est de 3.2 nm. La faible évolution du volume poreux et du diamètre des pores indiquent qu'il n'y a eu que peu de fonctionnalisation dans le système poreux des MSN et que le DTPA s'est majoritairement greffé en surface.