RESULTATS PRELIMINAIRES
RESULTATS PRELIMINAIRES
RESULTATS PRELIMINAIRES
OBJECTIFS
Nos travaux ont ainsi pu montrer que les lymphocytes T régulateurs peuvent induire une tolérance durable et spécifique vis-à-vis d’alloantigènes, non seulement dans le cadre d’une greffe de moelle osseuse mais également lors de la transplantation d’organes solides, tels le cœur et la peau. Dans ce dernier cas, nous avons également pu montrer que les Tregs protégeaient non seulement du rejet aigu mais, de façon plus importante, du rejet chronique.
Une des perspectives évidentes de ce travail consiste à étudier les mécanismes mis en place par les cellules régulatrices afin d’établir cette tolérance. Nous nous sommes donc tout naturellement intéressés aux cytokines anti- inflammatoires, IL-10 et TGF-b, connues pour être dans certains modèles, produites par les Tregs et indispensables à leurs fonctions immunosuppressives. Nous avons ainsi pu montrer dans le précédent article que les lymphocytes T effecteurs, responsables du rejet, doivent absolument être sensibles au TGF-β, sans quoi l’induction de tolérance ne peut plus avoir lieu. A l’inverse, l’IL-10, produite par les Tregs, ne semble jouer aucun rôle dans notre modèle de greffe de moelle osseuse. En revanche, son rôle s’avère majeur pour la survie à long terme du cœur.
Toutefois, hormis ces cytokines, il existe de nombreux autres mécanismes utilisés par les lymphocytes T régulateurs pour inhiber l’activation, la prolifération, la différenciation et/ou l’action des cellules effectrices. L’objectif de ce nouveau travail a donc été de faire un état de lieux des différents mécanismes impliqués. Etant donné son rôle majeur dans l’induction de la tolérance aux alloantigènes dans le cadre foeto-maternel, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’indoléamine 2,3 dioxygénase (IDO) et aux diverses molécules susceptibles d’induire sa production in vivo (IFN-γ, CD80/86).
RESULTATS PRELIMINAIRES
Introduction
Les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ Foxp3+ (Tregs) jouent un rôle crucial dans de nombreuses physiopathologies. Ainsi, il a été montré qu’ils participaient à la prévention de l’autoimmunité (401, 402) et des maladies immunoinflammatoires (403), dans la régulation de l’immunité anti-virale et anti- parasitaire (404, 405) et dans l’inhibition des réponses anti-tumorales (406). Plus récemment, il a également été montré que les Tregs étaient indispensables à la maintenance de la tolérance foeto-maternelle (383), c'est-à-dire à l’induction d’une tolérance vis-à-vis d’alloantigènes. Cette découverte, couplée à la capacité de ces cellules à inhiber l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) (398), a conduit de nombreuses équipes à envisager leur utilisation en transplantation, lors de protocole de thérapie cellulaire.
Notre équipe a ainsi pu montrer que des Tregs purifiés à partir d’animaux non manipulés et expandus in vitro de manière adéquate, induisent une tolérance vis-à- vis d’une greffe de moelle osseuse totalement allogénique chez des animaux faiblement irradiés. Plus important, consécutivement à ce conditionnement, les receveurs acceptent une greffe de cœur ou de peau sans présenter d’épisodes de rejet aigu ou chronique. Lors de ces travaux, nous avons également démontré que le TGF-β était indispensable à la prise de la greffe de moelle osseuse tandis que l’IL-10 participait à la survie à long terme du cœur.
D’autres mécanismes, dont l’implication varie d’un modèle à un autre, ont été associés aux lymphocytes T régulateurs. Ainsi, il a été montré par l’équipe de Kathrine Woods que la production transitoire d’IFN-γ par les Tregs est indispensable à l’induction de tolérance vis-à-vis d’alloantigène, suite à un traitement à base d’anticorps bloquant (301). Un autre mécanisme impliqué est l’intéraction entre la molécule CTLA-4 à la surface des cellules regulatrices et les molécules de co- stimulation CD80/86 à la surface des cellules effectrices (355). Enfin, de façon intéressante, il a été montré que les Tregs peuvent induire la synthèse de l’indoléamine 2,3 dioxygénase (IDO) par les cellules dendritiques (307, 401). Cette induction peut se faire soit par l’intéraction entre la molécule CTLA-4, à la surface de la cellule régulatrice, et les molécules de co-stimulation CD80/86 à la surface de la cellule dendritique soit par la production d’IFN-γ par la Treg. Une fois produite, cette enzyme permet le catabolisme du tryptophane. Ce faisant, l’IDO appauvrit le milieu en cet acide aminé essentiel et induit l’apparition de la kinurenine, un catabolite pro- apoptotique.
A la vue de ces données, et sachant que l’IDO a également été impliquée dans l’établissement de la tolérance foeto-maternelle, nous nous sommes intéressés au rôle de cette enzyme dans notre modèle d’induction de tolérance à une allogreffe
de moelle osseuse. Nous avons ainsi pu montrer que les productions d’IFN-g par les Tregs et d’IDO par les CPA ne sont pas nécessaires à la protection de la moelle osseuse. De même, les molécules CD80/86 à la surface des cellules effectrices n’est pas, dans notre modèle, nécessaire à l’établissement de la tolérance.
Matériel et Méthodes
Souris : toutes les souris utilisées sont des femelles agées de 6 à 8 semaines au début des expériences. Les lignées de souris IFN-γ-/-, CD80/86-/- et IDO-/- ont été entretenues au sein de notre animalerie, en respect des lois d’éthique en vigueur.
Anticorps : les anticorps avec les spécificités suivantes ont été utilisés pour analyser le chimérisme des animaux receveurs et la purification des Tregs : H-2Kb (AF6-88.5), H-2Kd (SF1-1.1), H-2Ks (5KH49) (BD PharMingen) ; CD4 (GK1.5), CD25 (PC61). Les surnageants d’hybridomes, reconnaissant le FcgRII/III (2.4G2), CD8 (53.6.7) le CMH de classe II (M5/114.15.2) et Thy1.2 (AT83) ont été produits dans notre laboratoire.
Tri des Tregs : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ ont été purifiés comme décrit précédement (407). Brièvement, le tri consiste dans un premier temps à éliminer les erythrocytes et les cellules mortes grâce à un gradient de Lympholyte M. Les cellules sont ensuite enrichies en CD4 par élimination des autres populations grâce à des anticorps dirigés contre CD8, CMH II et FcgRII/III et des billes de tri (DYNALBEADS). La population enrichie est ensuite sélectionnée positivement pour le marqueur CD25 à l’aide d’un anticorps dirigé contre CD25 et de billes de tri (MYLTENYI). La pureté obtenue en routine est supérieure ou égale à 95%.
Greffe de Moelle Osseuse : les greffes de moelle osseuse sont réalisées comme précédemment décrit (407). Brièvement, les souris receveuses sont irradiées à 500 Rad , 24 heures avant la greffe. Les cellules hématopoïétiques du donneur sont obtenues à partir des os longs des pattes postérieures (Fémurs et Tibias). Afin d’éviter tout risque de GvHD, les lymphocytes T contenus dans la moelle osseuse sont éliminés par déplétion au complément, à l’aide d’un anticorps dirigé contre Thy1.1 (AT83).
Analyse du chimerisme : 3 semaines après la greffe, le sang des receveurs est prélevé au niveau du sinus retro-orbital. Après élimination des erythrocytes, le sang est incubé avec des anticorps dirigés contre l’haplotype du CMH du donneur et du receveur.
Résultats
Lors de ses travaux, nous avons ainsi pu montrer l’implication des cytokines immunosuppressives TGF-β et IL-10 à diverses étapes du protocole d’induction de tolérance à une greffe de moelle osseuse puis d’organe solide. Nous nous sommes par la suite intéréssés aux autres mécanismes des Tregs intervenant dans l’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse.
Rôle de l’IFN-γγγγ dans l’induction de tolérance
Les récents travaux de Kathrine Woods et de son équipe ont mis en évidence une production transitoire d’IFN-γ par les lymphocytes T régulateurs. Dans leur modèle, reposant sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les molécules de co- stimulation, ils ont put montrer que cette production était indispensable à l’établissement d’une tolérance vis-à-vis des alloantigènes (301) . Dans ce cas, l’IFN- γ pourrait agir sur les cellules dendritiques et induire la synthèse de l’IDO, enzyme responsable du catabolisme du tryptophane et donc de la mise en place d’un milieu appauvrie.
Nous avons donc voulu étudier si la production d’IFN-γ par les cellules régulatrices jouait un rôle similaire dans notre propre modèle d’allogreffe. Pour cela, des souris B6 ont été irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange 1 :1 de moelles osseuses allogénique DBA/2 et syngénique. L’analyse à trois semaines du chimérisme au niveau du sang a montré que le greffon médulaire était accepté. A l’inverse, la « reconstitution » du système immunitaire des souris receveuses par l’injection de splénocytes B6 entraine un rejet rapide et total de la moelle osseuse allogénique. Dans ce modèle, déjà utilisé lors de nos premiers travaux (408) et des expériences sur le TGF-β, nous avons ensuite tenté d’inhiber le rejet médié par les splénocytes grâce à la co-injection de lymphocytes T régulateurs purifiés à partir de souris sauvage ou déficientes pour l’IFN-γ. Nous avons ainsi observé que les deux populations de Tregs étaient capables d’induire une tolérance comparable vis-à-vis des alloantigènes. La production de cette cytokine par les Tregs ne semble donc pas impliquée dans notre modèle.
Rôle de l’interaction CTLA-4 / CD80-86 dans l’induction de tolérance
Un autre mécanisme impliquant les Tregs et pouvant conduire à la synthèse d’IDO nécessite l’intéraction de la molécule CTLA-4, exprimée par les cellules régulatrices, avec les molécules de co-stimulation CD80/86 exprimées par les CPAs. Afin de tester ce mécanisme d’action dans notre modèle, nous avons eu recours, chez des souris irradiées létalement, à une greffe de moelle osseuse allogénique provenant de souris B6 déficientes pour CD80/86 : ainsi les CPAs qui permettront l’activation du système immunitaire ne pourront pas intéragir avec le CTLA-4 des
Tregs. Toutefois, ce système présente une faille : sans molécules de co-stimulation, les CPAs allogéniques se sont révélées, sans surprise, incapables d’activer efficacement les splénocytes injectés. La moelle osseuse n’a donc pas été rejetée, même en l’absence des cellules régulatrices. Au contraire, sa prise en est même facilitée. Ces résultats ne permettent donc pas de statuer sur l’implication de cette intéraction entre CPAs et Tregs.
CD80/86 n’est cependant pas exprimé exclusivement à la surface des CPAs. Ainsi, les lymphocytes T effecteurs, une fois activé, expriment ces molécules et peuvent devenir par là-même des cibles pour les Tregs. Afin de tester cette hypothèse, nous avons cette fois utilisé, toujours dans le même modèle d’irradiation létale, des splénocytes provenant de souris CD80/86-/-. Des souris B6 ont donc été irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange équivalent de moelles osseuses syngénique et allogéniques DBA/2. L’injection des splénocytes KO permet un rejet du greffon équivalent à celui entrainé par des splénocytes sauvages. A l’inverse, la co-injection de Tregs, cultivé in vitro en présence d’APC DBA/2, permet dans les deux cas, une protection du greffon médulaire. Nos résultats montrent donc que l’interaction entre le CTLA-4 des Tregs et les molécules CD80/86 des cellules effectrices n’est pas impliquée dans l’induction de tolérance vis-à-vis des alloantigènes.
Rôle d’IDO dans l’induction de tolérance
Enfin, nous nous sommes directement intéressés au rôle de l’indoléamine 2,3 dioxygénase dans la mise en place d’une tolérance durable. Pour cela, nous avons utilisé une moelle osseuse allogénique provenant de souris B6 défientes pour cette enzyme et avons comparé sa « prise » avec celle provenant de souris B6 sauvages, en présence de lymphocytes T régulateurs. Nos résultats montrent que les deux moelles ont été acceptées de manière identique, rejetant ainsi une implication de cette enzyme dans l’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse. Ces expériences ont par la suite été reproduites dans le modèle d’irradiation sous-létale, utilisé dans le Nature Medicine.
Discussion
Notre équipe a montré que les lymphocytes T régulateurs sont capables d’induire la protection d’une greffe de moelle osseuse. Plus important, cette protection passe par une tolérance durable et spécifique qui, si les Tregs sont convenablement activés, permet d’inhiber les phases de rejet aigu et chronique.
Si de nombreux mécanismes d’action ont été décrits pour les Tregs, ceux impliqués dans cette tolérance aux alloantigènes n’avaient pas encore été identifiés. Dans un premier temps, nous avons ainsi pu montrer que le TGF-β et l’IL-10 jouait
un rôle important dans l’établissement de cette tolérance, respectivement, vis-à-vis d’une greffe de moelle osseuse et de cœur.
Lors de ce travail, nous avons donc tenté de mettre à jour d’autres mécanismes. De par son implication dans la tolérance foeto-maternelle, l’IDO nous a semblé un candidat de choix. Toutefois, nos résultats n’ont pu mettre en évidence son implication dans la mise en place de la protection de la moelle osseuse. De même, nous avons testé, sans succès, les molécules communément décrites comme pouvant induire in vivo sa synthèse, à savoir la cytokine IFN-γ et les molécules de co- stimulation CD80/86, via l’intéraction avec CTLA-4. Ces résultats préliminaires tendent à nous faire penser que la voix de l’IDO n’est pas impliquée dans la tolérance établie par les Tregs et rejoignent ainsi ceux observés notamment par l’équipe de Sykes dans un modèle d’induction de tolérance par CTLA-4Ig (409).
Toutefois, ces résultats sont à modérer. En effet, dans le cas d’IDO, s’il semble que l’enzyme n’intervient pas dans les mécanismes conduisant à l’acceptation d’une moelle osseuse, nous devons encore réaliser les mêmes expériences lors de la greffe de peau ou de cœur, afin d’exclure qu’elle puisse jouer un rôle lors de la greffe d’organe solide, comme cela a été le cas de l’IL-10. Un tel comportement pourrait s’expliquer, là encore, par l’état d’inflammation, provoqué par l’acte chirurgical lui-même ou l’état d’ischémie de l’organe et associé à une production d’IFN-γ, plus important lors de greffe d’organes solides que lors d’une greffe de moelle osseuse, moins invasive. Ainsi, chez l’Homme, et contrairement à certains modèles animaux, si de nombreux rapports font état d’une expression d’IDO au sein de transplants indemnes de rejet, preuve d’un proccessus de tolérisation médié par l’enzyme (410, 411), tous font, pour le moment, référence à des transplantations d’organes solides.
Concernant l’IFN-γ, les résultats que nous avons obtenus montrent que sa production par les Tregs n’est pas nécessaire à l’établissement d’une tolérance à une allogreffe de moelle osseuse. Ces données sont en contradiction avec celles obtenues par Kathrine Woods où, dans son modèle, une production éphémère de cette cytokine est indispensable à l’inhibition des réponses allogéniques. La différence entre ces résultats peut s’expliquer par la différence des modèles utilisés. En effet, dans le cas de Woods, les lymphocytes T régulateurs sont induits in vivo par le traitement des receveurs à l’aide d’anticorps neutralisants tandis que dans notre cas, les Tregs sont naturellement présents chez le receveur. Nous pouvons donc imaginer que malgré des marqueurs phénotypiques similaires, nos deux populations régulatrices diffèrent. Parallèlement à cela, il est tout à fait possible qu’une production d’IFN soit bien, dans notre modèle, impliquée dans les processus de tolérisation mais que cette production ne soit pas le fruit des Tregs injectés. Cette production pourrait être assurée par différentes populations cellulaire : les lymphocytes T activés, les CPAs suite à l’intéraction avec les Tregs, mais, également des populations régulatrices induites par les Tregs injectés. Il s’agira donc en perspective de ce travail de reproduire nos expériences en utilisant des splénocytes
(T effecteurs ou T régulatrices induites) et/ou des moelles osseuses (CPAs) IFN-γ-/- chez des souris irradiées létalement.
Enfin, dans le cas des molécules de co-stimulation CD80/86, elles aussi capables d’induire la production d’IDO par les CPAs lorsqu’elles intéragissent avec le CTLA-4 des cellules régulatrices, nos résultats ne nous ont pas permis de conclure quant au rôle de cette voie. En effet, nous avons observé, comme attendu, qu’une greffe de moelle osseuse déficiente pour ces molécules ne s’accompagne pas d’un rejet, les cellules effectrices n’étant pas totalement activées. Il nous est donc impossible dans ces conditions de déterminer si les Tregs sont capables ou non d’induire une tolérance et par conséquent, si ces molécules sont impliquées. Pour ce faire, vu que, dans cette voie, les molécules CD80/86 intéragissent avec CTLA-4, il nous faudra tester la capacité de Tregs CTLA-4 déficientes à induire une tolérance vis-à-vis d’une allogreffe de moelle osseuse, dans notre modèle d’irradiation létale. Parallèlement à cela, nous avons pu écarter l’implication de l’intéraction entre le CTLA-4 des Tregs et les molécules de co-stimulation CD80/86 à la surface des cellules T activées.
Néanmoins, si ces résultats venaient à être confirmés, ils poseraient la question de savoir pourquoi une enzyme comme l’IDO, déjà montrée comme facilitant la mise en place d’une tolérance vis-à-vis d’alloantigènes, dans le cas de l’intéraction foeto-maternelle, et impliquées dans de nombreux modèles expérimentaux de transplantation, n’est pas induite ici. Là encore, l’origine des cellules régulatrices versus des cellules régulatrices induites in vivo (dans le cas des traitements aux anticorps neutralisants), ainsi que l’étape de pré-activation in vitro, susceptible de modifier le comportement de nos Tregs ou d’amplifier une sous- population particulière, pourrait en partie l’expliquer.