Nouvelles stratégies thérapeutiques

Les drogues immunosuppressives ont beaucoup apporté à la transplantation. Grâce à elles, ce qui n’était encore qu’un rêve à la sortie de la seconde guerre mondiale est devenu une solution thérapeutique couramment utilisée en clinique humaine. Pourtant, elles restent soumises à de nombreux effets secondaires, liés notamment à une expression de leur molécule cible, non restreinte au compartiment lymphoïde. De plus, les traitements n’affectant pas uniquement la réponse alloréactive, l’état d’immunosuppression induit est global. Ainsi, en comparaison avec des individus sains, les patients ayant bénéficiés d’une greffe d’organe présentent une fréquence accrue de cancers et d’infections diverses. Ceci se caractérise également par une mortalité amplifiée. Enfin, l’effet des drogues immunosuppressives actuelles sur l’apparition des épisodes de rejet chronique reste particulièrement faible. Ces différentes limites ont poussé la communauté scientifique à élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

En 1953, Billingham et fait une découverte sans précédent. En injectant in

utero une suspension de cellules allogéniques à des souris gestantes, son équipe a

montré qu’à leur naissance, les souriceaux acceptaient durablement une greffe de peau provenant d’un donneur génétiquement identique aux cellules administrées (101). Mais la prouesse tenait surtout au spectaculaire rejet par ces mêmes souriceaux d’une peau provenant d’un autre donneur allogénique. Ainsi, pour la première fois, il avait été montré que l’on pouvait manipuler le système immunitaire de manière spécifique afin de le forcer à accepter ce qui lui est étranger. La notion d’induction de tolérance au non-soi était née. Depuis, elle est devenue le Saint Graal que tout médecin en transplantation recherche. A l’inverse, ces expériences ont permis de mieux connaitre la tolérance au soi. Il est ainsi rapidement apparu que la tolérance observée était due à un microchimérisme qui se mettait en place chez les souriceaux à partir des cellules injectées.

Les études et les modèles pour reproduire les résultats de Billingham se sont donc multipliés mais seuls certains d’entre eux peuvent aujourd’hui prétendre à une application future chez l’homme.

•••• L’induction de chimérisme hématopoiétique

Dès 1945, Owen observa, chez des veaux ayant partagés la même circulation placentaire (102), l’existence d’un mélange d’erythrocytes de deux origines différentes. Chacun de ces veaux possédaient ainsi ses propres cellules et des cellules de son frère. De plus, ce chimérisme perdurait à très long terme. Peu après, Medawar montrait que chacun des faux-jumeaux étaient tolérants vis-à-vis d’une greffe de peau provenant de leur frère. Par la suite, les travaux de Billingham et Medawar mirent en évidence le fort potentiel thérapeutique d’un chimérisme dans le cadre de la transplantation (101). La pertinence d’une telle approche chez l’Homme, fut confortée quand des patients, ayant reçus au préalable une greffe de moelle osseuse pour raison thérapeutique, s’avérèrent tolérants à une greffe de rein provenant du même donneur, au point de pouvoir se passer de traitements immunosuppresseurs.

Dès lors, la communauté scientifique s’intéressa de près à ces mécanismes et tenta de repoduire au travers de divers modèles, l’induction d’une telle tolérance. Les premières expériences chez la souris, réalisées par Ildstad et Sachs, montrèrent que l’élimination totale du système hématopoïétique par irradiation létale et sa reconstitution par un mélange de moelle osseuse syngénique et allogénique permet d’obtenir une tolérance durable et spécifique du donneur vis-à-vis d’une greffe de peau de même fond génétique que la moelle (103). L’approche fut plus tard rendu moins toxique par l’utilisation d’une irradiation non-létale combiné à un traitement d’anticorps déplétants anti-CD4 et anti-CD8 (104). Lors de la reconstitution du système immunitaire de l’hôte, la tolérance est induite et maintenue par des mécanismes de sélection des cellules T neogénérées au niveau du Thymus, médiés principalement par la présence au niveau de la medulla de cellules dendritiques du donneur. L’établissement de cette tolérance permet par la suite l’acceptation d’une greffe d’organe provenant de la même origine, sans l’utilisation de traitements immunosuppresseurs.

Par la suite, des études chez le porc miniature et chez les primates non- humains ont clairement établis le principe selon lequel l’induction d’un chimerisme mixe dans des conditions non-myéloablatives est un moyen particulièrement efficace de promouvoir la tolérance. L’approche a également été étendue à l’Homme, lors de tests cliniques dans lesquels la tolérance a été induite chez certains patients sans induire de maladie contre le greffon ou de toxicité (105, 106). Ce point s’est révélé particulièrement prometteur, l’établissement d’un chimérisme ayant longtemps été freiné par la forte morbidité de la GVHD.

Pourtant, de nombreuses interrogations subsistent sur le chimérisme et sa capacité à induire une tolérance. Ainsi, l’établissement d’un chimérisme mixte persistant, s’il est relativement aisé chez les rongeurs, s’avèrent particulièrement difficile chez les primates et l’Homme. Le conditionnement des receveurs reste encore aujourd’hui très contraignant pour permettre la prise de la moelle osseuse. De plus, il est rapidement apparu que l’induction d’un chimerisme n’était pas systématiquement synonyme d’une tolérance. Ce phénomène, appelé « Split Tolerance », a d’abord été observé dans des cas de chimérime total, où toutes les cellules hématopoïétiques proviennent du donneur. Depuis, il a été clairement décrit dans différents modèles de chimérisme mixte (104, 107-110). Enfin, il est à noter que, même dans le cas où une tolérance a été induite, celle-ci peut brusquement disparaître, parfois plusieurs mois après son induction, impliquant le rejet de l’organe solide greffé.

Cette solution thérapeutique, quoique prometteuse, nécessite donc encore de nombreuses études afin de comprendre les mécanismes sous-jacents et pouvoir, à terme, induire une tolérance à chaque fois.

•••• Les Cellules Dendritiques Tolérogènes

Les cellules dendritiques jouent un rôle clef dans le contrôle de la réactivité du système immunitaire puisque ce sont elles qui vont présenter les alloantigènes aux cellules T effectrices. Cependant, si une fois matures, elles sont à l’initiation des mécanismes conduisant au rejet de greffe, elles participent à l’état immature aux mécanismes d’induction de tolérance. Cette dualité fonctionnelle a donc amené différents groupes à moduler l’état d’activation de ces cellules afin d’inhiber sélectivement le compartiment immun alloréactif et, ainsi, induire la survie à long terme de greffes allogéniques.

De nombreux travaux reposent sur l’utilisation de cellules dendritiques allogéniques immatures. Ces cellules sont notamment caractérisées par une faible expression des molécules du CMH II et de co-stimulation. Aussi, en l’absence de signaux activateurs, leur capacité à stimuler les lymphocytes T est extrêmement faible. Dans différents systèmes, il a même été montré qu’elles ont un potentiel tolérogène important. La première démonstration d’un tel potentiel des cellules dendritiques fut apportée par Lu et al. en 1995. Ils ont dérivé, en présence de GM- CSF et en l’absence d’IL-4, des cellules dendritiques à partir de précurseurs contenus dans la moelle osseuse. Après 8 à 10 jours de culture, ils ont montré que ces cellules induisent, de façon antigène spécifique, l’anergie réversible de lymphocytes T alloréactifs (111). Dans ce modèle, l’hyporéponse est associée à l’absence d’expression des molécules de co-stimulation par les CPAs puisque l’ajout d’un anticorps anti-CD28 in vitro permet de réverser le phénomène.

En 2000, la même équipe obtient des données analogues avec des cellules dendritiques dérivées en présence de faible quantité de GM-CSF et d’IL-4. Ces cellules sont résistantes à la maturation induite par différents stimuli tels que du LPS, du TNFα ou des anticorps anti-CD40. De phénotype immature, elles expriment que faiblement les molécules de co-stimulation CD80 et CD86 et sont incapables d’activer des lymphocytes T allogéniques in vitro. De façon spectaculaire, les auteurs ont pu démontrer l’efficacité de ces cellules dans un modèle de greffe cardiaque allogénique chez la souris. L’administration par voie systémique d’un faible nombre de cellules dendritiques immatures d’origine du donneur 7 jours avant la greffe, permet d’induire l’acceptation à long terme de façon spécifique (112).

Différents traitements pharmacologiques peuvent être employés pour générer,

in vitro, des cellules dendritiques immatures possédant des capacités tolérogènes.

Ainsi, un grand nombre de traitements immunosuppresseurs classiquement utilisés en clinique, en plus de leur action sur les cellules T, ciblent également les cellules dendritiques. Les Corticostéroïdes, la Rapamycine et la Cyclosporine peuvent notamment inhiber la maturation des cellules dendritiques (113).

Parallèlement, d’autres agents permettent l’induction de cellules dendritiques tolérogènes. La 1, 25 dihydroxy vitamine D3, par exemple, le métabolite actif de la vitamine D3, inhibe la différenciation et la maturation des cellules dendritiques humaines et murines in vitro. De plus, elle inhibe leur sécrétion d’IL-12 en réponse au LPS, alors que dans le même temps, leur sécrétion d’IL-10 est fortement augmentée. Tous ces effets ont pour conséquence d’inhiber la capacité des cellules dendritiques à activer les lymphocytes T alloréactifs, rendant les cellules T anergiques (114).

L’utilisation in vivo de la 1, 25 dihydroxy vitamine D3 dans des modèles de greffe a permis de montrer son efficacité. Ainsi, l’inocculation de cellules dendritiques de mâles prétraitées à la vitamine D3 chez une femelle syngénique quelques jours avant qu’elle ne reçoive une peau de mâle, est associée à l’acceptation durable de la peau greffée. A l’opposé, l’administration de cellules dendritiques mâles non prétraitées n’est pas associée à une augmentation de survie du greffon en comparaison aux souris contrôles n’ayant pas reçu de cellules dendritiques (115).

De plus, il a été montré que l’administration directe de vitamine D3 en association avec du mycophénolate mofétil induit l’acceptation durable de greffes cardiaques et d’îlots pancréatiques chez des souris. Les auteurs ont mis en évidence que chez les souris traitées, les cellules dendritiques autour de la greffe présentent un phénotype immature, attesté par une expression de CD40, CD80 et CD86

diminuée en comparaison avec des cellules dendritiques de souris non traitées. De même, lorsque ces cellules dendritiques purifiées sont mises en contact avec des lymphocytes T CD4 du donneur, elles sécrètent 10 fois moins d’IL-12 que leurs homologues provenant d’animaux non traités. Enfin la réponse T CD4 qui se développe est caractérisée par une faible production d’IFN-γ. Les auteurs on pu montrer que cette tolérance était transférable. En effet, des lymphocytes T CD4+ CD25+ purifiés à partir de la rate des souris tolérantes, cellules dont le pourcentage est augmenté par rapport aux souris contrôles, protègent des souris naïves du rejet de greffe d’îlots (116) : la tolérance induite serait donc dominante.

Parallèlement à la génération de cellules dendritiques tolérogènes ex vivo, une étude récente indique que l’administration de dérivés apoptotiques provenant des splénocytes du donneur, 7 jours avant la greffe cardiaque, permet d’augmenter de façon significative la survie du greffon (117). En effet les cellules dendritiques du donneur qui ont capturé les cellules apoptotiques restent immatures, et la présentation des peptides allogéniques aux lymphocytes T CD4, activés ici de manière directe, entraine leur anergie. Ces cellules CD4, une fois « activées », s’avèrent incapable de sécréter de l’IL-2 et de l’IFN-γ.

Cependant, ces différentes stratégies présentent de nombreuses limites. Ainsi, il a été montré que ces cellules peuvent maturer in vivo et conduire à l’accélération du rejet de l’organe. Ceci peut toutefois être contrôlé par l’injection d’anticorps bloquant l’interaction CD40/CD40L (118). Enfin, d’un point de vue logistique, il apparaît difficile d’injecter une semaine avant la greffe des cellules dendritiques dérivées de tissus prélevés chez un donneur cadavérique.

Pour pallier cela, des stratégies reposant sur des cellules dendritiques syngéniques ont été proposées. La pertinence de cette approche est suggérée par le fait que l’induction de tolérance à des alloantigènes a été décrite, dans différents systèmes, comme nécessitant une voie d’alloreconnaissance indirecte fonctionnelle (119, 120). Ainsi, il a été montré dans des modèles de greffe cardiaque allogénique chez le rat par l’équipe du Dr Cuturi que l’injection de cellules dendritiques syngéniques immatures permet d’augmenter significativement la survie de l’organe transplanté (121). Mieux, lorsque l’injection des cellules dendritiques est suivie d’un traitement suboptimal de LF15-095, un état de tolérance durable et spécifique de l’antigène est induit (122). Cet analogue de la deoxyspergualine pourrait potentialiser l’action des cellules dendritiques en inhibant leur maturation in vivo.

De façon intéressante, le même groupe a montré que l’administration d’exosomes provenant du donneur après la transplantation, en association avec du LF15-095, est capable d’induire une tolérance spécifique des alloantigènes du donneur, caractérisée par une profonde inhibition des réponses prolifératives « anti- donneurs ». De plus, ce traitement permet de retarder significativement le rejet chronique. Ces données montrent que la présentation des molécules du CMH du donneur à la surface des exosomes peut induire le développement de réponses

« régulatrices » capables d’induire une tolérance vis-à-vis du donneur, même si ces exosomes sont administrés après la greffe (123).

Enfin, une dernière approche concernant l’utilisation de cellules dendritiques tolérogènes, consiste à manipuler ces cellules in vivo afin d’optimiser leurs capacités tolérogènes (124). En ce sens, l’expression de différentes molécules aux propriétés immunosuppressives a été induite dans ces cellules par génie génétique. Afin de bloquer l’expansion clonale des lymphocytes T allospécifiques, et/ou d’induire leur apoptose, des stratégies ont consisté à transfecter les cellules dendritiques avec le gène codant pour l’indoléamine-2,3 dioxygénase (IDO). De même, afin de promouvoir l’anergie ou la délétion des cellules effectrices, l’expression de molécules telles que PDL-1 ou FasL a été forcée à la surface des CPAs. L’inhibition de l’expression des molécules de co-stimulation, indispensable à une bonne activation des lymphocytes T, a été envisagée via un effet autocrine, après transfection des cellules dendritiques avec les gènes codant pour l’IL-10 ou le TGF-β.

•••• Blocage des co-récepteurs

Dans les années 90, l’équipe de Herman Waldmann a développé des protocoles d’induction de tolérance basés sur l’administration, d’anticorps anti-CD4 non déplétants. Ces traitements permettent l’acceptation de greffes cardiaques allogéniques (125). L’addition d’anticorps anti-CD8 ou anti-CD40L, entraine une tolérance durable et spécifique du donneur, à savoir que l’animal ainsi « tolérisé » accepte une seconde greffe de même origine que la première alors qu’il rejette une greffe d’origine différente (126). Les auteurs ont mis en évidence que cette tolérance peut être transférée chez un hôte naïf : c’est la tolérance dominante (127). Celle-ci serait dépendante d’une population de lymphocytes T CD4+ possédant des propriétés immunorégulatrices. En effet, ces cellules, quand elles sont transférées, ont la capacité d’empêcher le rejet d’une greffe de même origine que celle de la greffe qu’a reçue l’animal tolérisé.

Ces protocoles d’induction de tolérance utilisant des anticorps dirigés contre les co-récepteurs ont connu peu de succès, en dehors du groupe de H. Waldmann. Ceci est probablement dû à l’engouement général envers les anticorps bloquant les signaux de co-stimulation. De plus, l’état de tolérance qui se développe suite à l’administration de ces anticorps s’acquiert seulement après plusieurs semaines de traitement (128).

•••• Blocage des molécules de co-stimulation

Les succès rencontrés par les protocoles d’induction de tolérance à l’aide d’anticorps développés par Waldmann, ont conduit de nombreuses équipes à élargir

l’éventail de molécules cibles. Etant donnée leur importance pour une activation efficace du système immunitaire, les molécules de co-stimulation sont rapidement apparues comme d’excellents candidats.

Il existe une grande variété de voies de co-stimulation ; cependant B7/CD28/CTLA-4 et CD40/CD40L est probablement la plus importante et certainement la mieux caractérisée à ce jour. De même, CD40/CD40L, malgré le fait qu’elle ne fasse pas intervenir à proprement parler des molécules de co-stimulation, a été bien décrite. Ces deux voies ont ainsi concentré toute l’attention de la communauté scientifique. Toutefois, si de nombreux modèles ont été mis au point chez les rongeurs, seul le blocage de la voie B7/CD28 a fait l’objet d’essais cliniques et d’études approfondies chez les primates non humains.

L’interaction entre CD28 à la surface de la cellule T et les molécules B7 à la surface des APCs peut être bloquée par des anticorps anti-B7 et par CTL4-Ig, une protéine recombinante constituée du domaine extracellulaire de CTLA-4 fusionné à la chaîne lourde d’une immunoglobuline. L’utilisation de ces anticorps prévient le rejet aigu d’allogreffe et induit parallèlement une tolérance spécifique vis-à-vis des antigènes du donneur. Cependant, il est à noter que le blocage n’est pas efficace dans toutes les souches de souris, ni dans toutes les combinaisons.

Une seule dose de CTLA4-Ig permet d’augmenter de façon significative la survie du rein greffé chez la majorité des rats traités (129). Néanmoins, il semble que l’administration d’antigènes du donneur sous la forme de transfusion de splénocytes du donneur (DST) soit nécessaire pour obtenir une acceptation durable et pour prévenir le rejet chronique des cœurs greffés (130). La DST potentialiserait l’action de l’administration de CTLA4-Ig en fournissant aux lymphocytes T alloréactifs un important stimulus pour leur TCR. Dans le même temps, le blocage des molécules de co-stimulation ne permettrait pas aux lymphocytes T d’obtenir une activation optimale. Il en résulterait une anergie ou l’apoptose des cellules T.

CTLA4-Ig permettrait l’acceptation durable via plusieurs mécanismes. Tout d’abord, il réduirait la fréquence des cellules T alloréactives qui prolifèrent en augmentant parallèlement leur sensibilité à l’apoptose. En accord avec cela, des agents pharmacologiques comme la Rapamycine qui augmente l’AICD potentialise l’apoptose induite par l’administration de CTLA4-Ig, alors que la cyclosporine la diminue (131).

Un deuxième mécanisme a récemment été découvert. Grohmann et al. ont pu montrer que la liaison de CTLA4-Ig aux molécules B7 induit l’expression de l’enzyme IDO par les cellules dendritiques in vitro. Celle-ci va métaboliser le tryptophane en kynurénine, métabolite entraînant l’apoptose des lymphocytes T. De façon intéressante, les auteurs ont mis en évidence que l’état de tolérance induit par l’administration de CTLA4-Ig était dépendant du catabolisme du tryptophane in vivo. Si des îlots pancréatiques allogéniques étaient durablement acceptés chez des souris recevant du CTLA4-Ig, ils étaient rapidement rejetés lorsque était coadministré

du 1-methyltryptophane, un inhibiteur d’IDO (132). Ces résultats sont en accord avec des études qui montraient l’importance d’une interaction B7/CTLA4-Ig intacte dans l’induction de tolérance. Ainsi, la tolérance induite par un traitement associant CTLA4-Ig et une DST était prévenue lorsque des anticorps Anti-CTLA4 étaient administrés de façon concomitante (133).

Des résultats similaires à ceux obtenus avec blocage de la voie CD28/B7 ont été observés avec l’utilisation d’anticorps monoclonaux anti-CD40L (anti-CD154).

In vivo, le blocage de cette voie va avoir, entre autres, pour conséquence d’altérer la

maturation des cellules dendritiques, leur présentation d’antigène ainsi que leur capacité à activer les lymphocytes T (134). Chez des souris ayant reçu des anticorps anti-CD40L et une DST, on observe l’augmentation significative d’une population de lymphocytes T CD4+ CD25+, nécessaires pour induire un état de tolérance durable chez le receveur. Chez ces animaux, une forte expression des ARNm codant pour Foxp3, un marqueur des populations régulatrices, est observée dans les greffons cardiaques des souris tolérisées (135).

Il semble que comme pour l’administration de CTLA4-Ig, le traitement des souris receveuses avec des anticorps anti-CD40L pendant les premiers jours suivant la greffe ne soit pas suffisant pour induire l’acceptation durable des greffes cardiaques (136) ou d’îlots pancréatiques allogéniques (137). En effet, il apparait que les lymphocytes T CD8 qui sont plus résistants au blocage de CD40, sont à l’origine, chez les souris ne possédant pas une voie de signalisation CD40/CD40L fonctionnelle, du développement du rejet chronique (138, 139). Comme pour le blocage de CD28, une DST est dans les deux cas nécessaire pour atteindre une tolérance à long terme sans survenue de rejet chronique (136, 137).

Des stratégies visant à combiner le blocage des deux voies ont provué leur