2.2.1 La formation du Ci-Activateur : implication de phosphorylations par la kinase Fu ? De nombreuses publications ont montré que l’activation de la kinase Fu par Hh est nécessaire à l’expression des gènes cibles de la voie. Ceci suggère une probable fonction de Fu sur la formation du Ci-Act au sein du complexe de transduction qui est maintenant qualifié d’activateur en raison de la présence d’Hh. Cependant, jusqu’à présent, aucun lien n’avait été fait entre ces deux protéines, et nos résultats, que nous allons discuter dans les paragraphes suivants, établissent clairement une relation directe entre Fu et Ci.
L’analyse par Western Blot de l’état biochimique de la protéine Ci en présence de différentes protéines, dans des cellules induites ou non pour Hh, ainsi que l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des phosphatases, nous a permis de démontrer que Ci est phosphorylée en présence d’Hh. Cette phosphorylation est dépendante d’une forme de Fu activée (Fig. 37a), et est augmentée par Smo (Fig. 37d). Suite à cette observation, nous avons cherché et identifié des sites putatifs de phosphorylation de Fu dans le domaine N-terminal de Ci, dont la fonction sur Ci a été validée par des expériences de Western Blot et par des mesures d’activité transcriptionnelle à l’aide de gènes rapporteurs. Néanmoins, l’expression des protéines Fu et Ci dans un système de baculovirus, suivie d’une analyse par spectrométrie de masse des formes de Ci phosphorylées par Fu, sera nécessaire pour confirmer ces sites. De manière intéressante, nous avons remarqué que les séquences potentielles de phosphorylation de Fu sur Ci se situent proche du domaine de fixation de Sufu (Methot et Basler, 2000 ; Monnier et al., 1998), mais aussi de HIB, protéine appartenant au complexe ubiquitine ligase E3 de type CBC (Zhang et al., 2006). Ces deux protéines ont des actions opposées concernant la stabilité de Ci, puisque l’expression de Sufu abolit la dégradation de Ci causée par HIB, indiquant que Sufu stabilise Ci (Zhang et al., 2009). Ainsi, le domaine N-terminal de Ci est le lieu d’une compétition entre Sufu et HIB pour la régulation de l’homéostasie cellulaire de Ci. Sachant que, sous l’effet d’Hh, la kinase Fu est activée et phosphoryle Sufu (Shi et al., 2011 ; Lum et al., 2003) et Ci, il est probable que la phosphorylation de Ci par Fu renforce le rôle protecteur de Sufu vis à vis de Ci, et favorise ainsi sa translocation dans le noyau (Shi et al., 2011 ; Sisson et al., 2006). Cependant, l’étude récente Oh et al., 2015, a montré que la phosphorylation de Sufu par Fu n’a aucun rôle fonctionnel dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de Ci en présence d’Hh. En effet, la mutation des sites de phosphorylation de Fu sur Sufu ainsi que la délétion du domaine d’interaction entre SuFu et Fu n’empêchent pas l’activation de Ci in vitro et in vivo. De ce fait, et malgré le rôle primordial de Sufu chez les vertébrés, il semblerait que la protéine Sufu n’est pas de fonction chez la Drosophile en présence d’Hh.
Contrairement aux phosphorylations de Fu sur Sufu, la phosphorylation de Fu sur Ci a une importance dans le mécanisme d’activation de Ci. Afin de renforcer l’idée que la kinase Fu est responsable de la formation du Ci-Act en présence d’Hh, nous avons évalué l’effet d’une forme de Fu constitutivement activée (Fu-EE) dans des disques sauvages ou mutants
pour smo, qui code pour une protéine essentielle dans le passage d’un complexe répresseur à un complexe activateur. De manière intéressante, l’expression de Fu-EE dans des disques où Smo a été enlevé par ARNi, révèle une absence d’activation des gènes cibles de la voie, alors que Fu-EE est capable de phosphoryler Cos2. L’analyse en immunofluorescence révèle que l’expression de Fu-EE dans un contexte mutant pour smo induit la production constitutive du Ci-Rep. Ce résultat apparait tout à fait paradoxal, puisqu’on a un complexe Fu/Cos2 activé par phosphorylation, qui conduit à la formation de l’isoforme répressive de Ci et non activatrice. Mais ce paradoxe est en accord avec le papier de Ranieri et al., 2014, puisque l’absence de Smo, empêche la relocalisation de la PKA au sein du complexe de transduction. De ce fait, la PKA reste associée à Ci, formant inlassablement du répresseur, alors que le complexe Fu/Cos2 est activé par phosphorylation. L’analyse de disques d’ailes dans lesquels la forme Fu-EE est exprimée en absence des protéines Smo et PKA sera nécessaire pour valider cette interprétation. Dans cette expérience, on s’attend à une activation ectopique de la voie Hh, car le Ci-Rep ne peut plus être formé alors que Fu va constamment phosphoryler et activer Ci155.
Nos données indiquent que Fu permet la formation du Ci-Act, probablement par phosphorylation, conduisant à l’activation des gènes cibles de la voie. La possibilité que Fu phosphoryle Ci sous-entend l’existence d’une interaction directe entre Fu et Ci, association que j’ai montrée dans les résultats et qui mérite d’être discutée dans le paragraphe ci- dessous.
2.2.2 L’interaction entre Fu et Ci : un changement de conformation de plus dans le complexe de transduction sous l’effet d’Hh !
L’étude du rôle de la kinase Fu sur la protéine Ci, nous a conduit à analyser et découvrir une interaction constitutive entre Fu et Ci par l’utilisation de différentes techniques comme la co-immunoprécipitation et la BiFC. Ce résultat nous a d’abord quelque peu surpris, car nous pensions visualiser cette interaction seulement en présence d’Hh, condition où la kinase Fu est supposée agir sur Ci, et non pas en absence d’Hh. Cependant, Ranieri et al., 2014 ont montré qu’en absence d’Hh, la PKA interagit avec la région C- terminale de Ci (Ci-C), et que Fu forme un complexe stable avec la PKA, indiquant la présence d’un complexe ternaire entre ces protéines. De plus, j’ai montré que Fu est également capable d’interagir directement avec l’extrémité C-terminale de Ci. Les expériences de BiFC réalisées entre Fu et Ci, nous ont aussi révélé une augmentation de cette interaction en présence d’Hh, suggérant un rapprochement des fluorochromes, probablement causé par un changement de conformation entre ces deux protéines. Sachant que nous avions localisé des sites putatifs de phosphorylation de Fu dans la partie N- terminale de Ci (Ci-N), nous avons émis l’hypothèse que la présence d’Hh puisse être responsable d’une relocalisation de Fu de Ci-C à Ci-N. Cette idée a été validée à la fois par l’utilisation des techniques de BiFC (Fig. 44-1) et de co-immunoprécipitations (Fig. 44-2c), dans lesquelles des fragments de la protéine Ci ont été utilisés. De façon intéressante, quand Fu interagit avec Ci-N, il emmène avec lui la PKA, formant ainsi un autre complexe ternaire,
concentré cette fois-ci vers Ci-N (Fig. 45d). Néanmoins la conformation entre les protéines PKA/Fu/Ci n’est pas la même selon la localisation des kinases PKA/Fu du côté Ci-N ou Ci-C, car la PKA n’est pas capable d’interagir avec Ci-N. Sachant que l’association entre les protéines PKA/Fu/Ci-N est représentative de la présence d’Hh, puisque que Fu interagit préférentiellement avec Ci-N quand les cellules sont traitées avec Hh (Fig. 44-1f, g, h, i et Fig. 45b), il est logique que la PKA n’interagisse pas avec Ci puisque le signal Hh bloque la PKA par sa relocalisation vers Smo.
Ces résultats, associés à ceux de la littérature, nous ont permis de mieux comprendre l’effet d’Hh sur les interactions différentielles entre les protéines du complexe de transduction. Dans le complexe répresseur, les kinases PKA et Fu s’associent chacune avec le domaine C-terminal de Ci aboutissant à la formation du Ci-Rep. Dans cette configuration, Fu n’est pas actif alors que la PKA, par proximité, va phosphoryler et permettre ainsi la maturation de Ci en répresseur. La présence d’Hh entraine la relocalisation de la PKA vers Smo, ce qui a pour conséquence l’éloignement de la PKA de Ci. Dans cette conformation, Smo bloque la fonction de la PKA sur Ci, mais active la kinase Fu par directe interaction, qui va, par proximité, phosphoryler l’extrémité N-terminale de Ci, entrainant probablement la formation du Ci-Act. Une des explications possibles du déplacement de Fu vers Ci-N est d’imaginer que le départ de la PKA induise la libération d’un espace autour de Ci, laissant à Fu un accès pour se mouvoir de Ci-C à Ci-N. Une façon de vérifier cette théorie serait de mesurer l’interaction entre Fu et Ci dans des cellules où la PKA a été enlevée par ARNi. Dans cette expérience, l’absence de la PKA devrait avoir pour conséquence une augmentation de l’interaction Fu/Ci similaire à celle observée quand on compare des cellules traitées ou non avec Hh.
Dans cette partie de la discussion consacrée à la régulation de Ci par la kinase Fu, nous avons pu nous rendre compte que la fonction de Fu sur Ci est dépendante des autres protéines du complexe, en particulier de la PKA et Smo. Les trois protéines PKA/Fu et Smo jouent un rôle crucial dans la régulation de Ci en absence ou en présence d’Hh, en raison des connexions qu’elles tissent les unes avec les autres. La visualisation de ces associations différentielles, qui va être discutée dans le paragraphe suivant, constitue une manière d’analyser l’effet d’Hh sur le complexe de transduction et les gènes cibles de la voie.
2.3 La détection des complexes répresseurs et activateurs : un nouvel outil dans