Le complexe répresseur Fu/Cos2

L’importance de Cos2 dans l’inhibition de la voie Hh vient de l’observation que dans des clones mutants « perte de fonction » de Cos2, Ci 155 s’accumule. Ceci indique une diminution de la formation du Ci-Rep, probablement due à un défaut de protéolyse du Ci- 155 (Sisson et al., 1997; Wang et Holmgren, 2000). A l’inverse, la surexpression de Cos2 dans le disque de l’aile entraine une diminution de l’expression de Ci (Wang et Holmgren, 2000), associée à une réduction de l’expression d’un ptc-lacZ, confirmant un rôle négatif de Cos2 sur la voie Hh. Cos2 est une protéine de type kinésine (Farzan et al., 2008; Sisson et al., 1997; Wang et Jiang, 2004), capable de se déplacer le long des microtubules (MTs : « Microtubules ») en hydrolysant de l’ATP. Cos2 est formée par trois domaines : un domaine moteur (MT) constitué du site de fixation à l’ATP et du site de fixation des microtubules situé dans sa partie N-terminale ; un domaine « Hep repeats » localisé dans sa région centrale et qui aurait un rôle dans sa dimérisation ; un domaine Cargo dans sa partie C-terminale, qui servirait à interagir avec des molécules destinées à être transportées (Goldstein, 1993) ou avec d’autres protéines de la voie Hh, notamment avec Smo. Les protéines Fu et Ci

interagissent avec Cos2 dans des domaines déjà identifiés (Monnier et al., 2002; Fig. 27).

Fig. 27 : Représentation schématique de la protéine Costal2

Cos2 est caractérisée par la présence d’un domaine moteur en N-terminal, responsable de la liaison aux microtubules, d’un domaine « Hep repeats » et d’un domaine Cargo dans son extrémité C- terminale. La position des domaines de fixations aux différents composants de la voie Hh est indiquée sur le schéma. Les deux sérines phosphorylées par Fu sont également annotées. La sérine 572 se trouve dans le domaine d’interaction avec Fu alors que la sérine 931 se localise dans la zone d’interaction avec Smo (modifiée à partir de l’HDR de Laurent Ruel).

En absence d’Hh, Cos2 peut agir de différentes manières pour inhiber la voie Hh. Cos2 peut par exemple promouvoir la formation du Ci-Rep (Zhang et al., 2005). Grâce à des expériences d’immuno-précipitation et de localisations subcellulaires, les auteurs ont montré que Cos2 forme un complexe avec les kinases PKA/CK1 et GSK3, kinases responsables de la phosphorylation de Ci et par conséquent de la formation du Ci-Rep. De plus, l’expression de ces kinases, dans des clones mutants pour Cos2 où normalement Ci-155 s’accumule, restaure la formation du Ci-Rep. Ces expériences suggèrent que Cos2 agit comme une protéine d’échaffaudage en rapprochant le substrat Ci, de ses kinases (PKA/CK1 et GSK3), permettant la maturation de Ci au sein du complexe que l’on peut qualifier de « complexe répresseur ».

Cependant, Cos2 semble pouvoir inhiber l’activité de Ci par un autre mécanisme que celui impliquant la formation du Ci-Rep. En effet, la surexpression d’un mutant de ci ne pouvant pas être protéolysé, induit l’expression ectopique de Ptc. La co-expression de ce mutant avec Cos2 restaure un niveau normal de Ptc, indiquant que Cos2 inhibe l’activité de Ci indépendamment de sa protéolyse (Wang et Holmgren, 2000). Des expériences de Chen et al.,1999 montrent que la surexpression de Cos2 dans des cellules en culture bloque l’entrée de Ci dans le noyau. Ceci suggère que Cos2 agirait sur l’activité de Ci en séquestrant Ci dans le cytoplasme, l’empêchant ainsi d’aller activer ces gènes cibles dans le noyau des cellules. D’ailleurs, les expériences in vivo de Wang et Holmgren en 2000 sont venues renforcer l’idée apportée par Chen et al., 1999. Afin d’évaluer le rôle de Cos2 dans l’import nucléaire de Ci, ils ont traité des disques mutants pour Cos2 avec du LMB (leptomycin B), drogue bloquant l’export nucléaire de Ci. Dans ces disques, ils ont observé une accumulation de Ci dans le noyau, confirmant que Cos2 est requis pour empêcher l’entrée de Ci dans le noyau. De plus ils ont identifié le domaine CORD (Costal2 responsive domain) de Ci, comme étant suffisant pour entrainer sa séquestration dans le cytoplasme par Cos2.

Etant donné que Cos2 est une kinésine, il est probable que les MTs participent à la fonction inhibitrice de Cos2, soit en favorisant la formation du Ci-Rep, soit en séquestrant Ci dans le noyau ou bien les deux. Cos2 interagit avec les microtubules seulement en absence d’Hh (Robbins et al., 1997; Sisson et al., 1997; Stegman et al., 2000). Farzan et al., ont montré que Cos2 peut se déplacer le long des MTs en transportant Fu et Ci. Un mutant de

cos2, incapable d’hydrolyser de l’ATP (S182N), interagit toujours avec les MTs ainsi que Ci,

mais est incapable de se déplacer le long des MTs (Farzan et al., 2008). L’analyse par Western Blot des différentes formes de Ci a révélé que le mutant Cos2 S182N affecte l’activité de Ci indépendamment de la formation du Ci-Rep (Ho et al., 2005). L’ensemble de ces résultats semble indiquer que les MTs contribuent à la fonction inhibitrice de Cos2 en séquestrant Ci dans le cytoplasme et non pas en agissant sur la formation du Ci-Rep.

Cependant une nuance est à prendre en compte dans le rôle de Cos2 dans la voie Hh. En effet, l’expression de Cos2 à des niveaux non physiologiques bloque toutes les formes de Ci, dont le Ci-Act, dans le cytoplasme, conduisant à la perte d’activation de la voie, suggérant une fonction positive de Cos2 sur Ci. L’analyse plus en détail des phénotypes mutants de

accumulation de Ci-155 sans activation des gènes cibles à hauts niveaux (Wang et Holmgren, 2000). Le rôle activateur de Cos2 sera abordé plus tard au cours de ce chapitre.

L’autre protéine essentielle au complexe cytoplasmique est la protéine kinase Fu. Fu est une sérine/thréonine kinase constituée d’un domaine catalytique en N-terminal (Cat) et un domaine régulateur en C-terminal (Reg) (Fig. 28).

Fig. 28 : Représentation schématique de la protéine Fused

Fu est composé d’un domaine catalytique en N-terminal, qui interagit avec Cos2 et d’un domaine régulateur en C-terminal, qui se lie avec de nombreuses protéines : Sufu, Smo et Cos2. La PKA semble interagir à cheval entre les deux domaines (Ranieri et al., 2014). Les sites de phosphorylation annotés participent à l’activation de la kinase Fu. (Adaptée à partir de l’HDR de Laurent Ruel).

L’étude de cette protéine dans la voie Hh est basée sur l’utilisation de différents

allèles mutants. Les allèles de classe I, par exemple fu1_{, sont caractérisés par une mutation}

du domaine kinase de Fu, résultant en une perte de son activité kinase (Alves et al., 1998; Therond et al., 1996). Les allèles de classe 2, l’instar de fuA_{, sont une délétion du domaine C-}

terminal de Fu. Une observation rapide de ces allèles donne plutôt un rôle activateur à Fu, puisque les ailes des mouches portant ces allèles mutants affichent une réduction de l’espace entre les veines 3 et 4, phénotype caractéristique d’une inactivation de la voie Hh. Cependant dans ces disques, une activation ectopique de Dpp est observée avec une stabilisation de Ci-155 et une absence de Ci-Rep (Alves et al., 1998). Cette expérience suggère que Fu a une fonction dans la formation du Ci-Rep, ou bien que la protéine Fu joue un rôle dans la répression des gènes cibles. Ce phénotype rappelle celui des clones mutants de cos2, indiquant une relation entre ces deux protéines dans la régulation de Ci. Comme je l’ai dit plus haut, Fu, Cos2 et Ci forment un complexe (Robbins et al., 1997) au sein duquel Fu interagit par son domaine régulateur avec Cos2 (Monnier et al., 2002). D’ailleurs, dans les mutants de classe II, où le domaine régulateur est délété, l’interaction entre Fu et Cos2 est abolie alors que cette interaction est toujours présente dans les mutants fu de classe I, indiquant que l’activité kinase de Fu n’est donc pas requise pour la liaison entre Fu et Cos2 (Robbins et al., 1997). Ces résultats suggèrent que le rôle répressif de Fu pourrait être

attribué à sa capacité à former un complexe avec Cos2 via son domaine régulateur. Une étude menée par Ascano et al., 2002 renforce cette idée en montrant que le domaine régulateur de Fu se comporte comme un dominant négatif en réprimant la voie. L’ensemble de leurs résultats indique qu’en absence d’Hh, Fu est nécessaire à maintenir l’intégrité du complexe répresseur Fu/Cos2/Ci, complexe qui inhibe l’activité de Ci en permettant la formation du Ci-Rep et l’import de Ci dans le noyau.

De manière intéressante, en plus de sa fonction de protéine d’échaffaudage dans le complexe répresseur, Fu a été montrée comme pouvant inhiber la voie Hh en agissant négativement sur Smo (Malpel et al., 2007). Les auteurs de ce papier ont d’abord observé une colocalisation de Fu et Smo dans des vésicules en absence d’Hh. De manière intéressante, ils ont identifié que les 59 derniers acides aminés de la queue cytoplasmique de Smo étaient suffisants pour interagir avec Fu. L’utilisation d’un mutant délété de ses 59 derniers acides aminés (SmoΔFu) leur a permis de montrer que le recrutement de Fu par Smo dans les vésicules était dépendant de ce petit domaine. L’expression de SmoΔFu conduit à la stabilisation de Ci-155 ainsi qu’à l’activation ectopique des gènes cibles. Ce résultat a été confirmé par l’analyse d’ailes dans lesquelles l’expression de SmoΔFu induit un phénotype d’activation de la voie. De plus, l’expression de SmoΔFu dans des individus mutants pour fu, et plus particulièrement avec des allèles de classe 1 (perte de l’activité catalytique de Fu), restaure un phénotype sauvage. Ceci suggère que l'activité kinase de Fu est nécessaire à l'effet inhibiteur de Fu sur Smo. Les auteurs sont arrivés à la conclusion que les 59 derniers acides aminés de Smo interagissent avec Fu et que cette interaction, en absence d’Hh, conduit à inhiber le signal Hh. Dans le chapitre consacré aux résultats, je réétudierai et confirmerai l’effet de SmoΔFu, mais je fournirai une interprétation différente de son effet avec de nouvelles données.

Comme je l’ai expliqué au-dessus, le rôle du complexe répresseur, et en particulier de Fu et de Cos2, est de permettre la formation du Ci-Rep en absence d’Hh. Pour cela, ils agissent comme une plateforme afin de rapprocher Ci des kinases impliquées dans sa maturation en répresseur, notamment PKA, CK1 et GSK3.