Les différentes isoformes de Ci en fonction du signal Hh

La protéine Ci est le seul facteur de transcription de la voie de signalisation Hh. Ci est une protéine de 155 Kda qui contient un domaine de fixation à l’ADN de type « Zinc Finger » dans sa région N-terminale ( Slusarski et al., 1995) et un domaine nécessaire à l’activation de la transcription, le domaine CBP (« CREB Binding Domain ») dans sa partie C-terminale (Chen et al., 1999). Deux sites de localisation nucléaire (NLS : « nuclear localization signal ») et d’exportation nucléaire (NES : « Nuclear Export Signal ») sont situés sur Ci afin de lui permettre de naviguer entre le cytoplasme et le noyau, et ainsi d’exercer sa fonction de

facteur de transcription (Wang et Holmgren, 1999; Fig. 26a).

Selon le signal, Ci existe sous différents états dans la cellule. En absence d’Hh, Ci est un répresseur de 75KDa (Ci-Rep) (Aza-blanc et al., 1997), et les mécanismes permettant sa formation seront décrits au cours de ce chapitre. Le signal Hh induit la présence d’au moins deux isoformes de Ci en fonction de la quantité d’Hh. Pour des niveaux intermédiaires d’Hh,

une forme dite Ci-155 ou Ci-FL (« Full lengh ») régule l’expression des gènes cibles activés à des niveaux faibles ou intermédiaires d’Hh. A des niveaux élevés, Hh induit l’apparition du Ci activateur (Ci-Act), mais les mécanismes permettant sa formation ne sont toujours pas connus à l’heure actuelle. La différence d’activité entre ces deux protéines est due à leur région C-terminale. Cette région contient le domaine CBP qui est responsable de l’association de la polymérase (Pol II) et de co-activateurs de la transcription avec Ci. Ces associations favorisent l’ouverture de la chromatine et ainsi l’activation de la transcription. La délétion de ces domaines conduit à l’absence de la transcription des gènes cibles, confirmant l’importance de cette région dans le rôle activateur de Ci (Alexandre et al., 1996). Ci-Rep ne possède pas de domaine CBP qui a été enlevé lors d’un processus protéolytique contrôlé, et de ce fait, il ne peut pas s’associer avec l’ARN pol II et les co-activateurs de la transcription. La protéine Ci-Rep est capable de se fixer sur l’ADN, mais incapable d’activer la transcription. De plus, récemment une étude a identifié le complexe Atrophin-Rpd3 agissant comme un co-répresseur de Ci. Celui s’associe au domaine N-terminal de Ci seulement en absence d’Hh, et régule négativement la transcription des gènes en jouant sur les niveaux d’acétylation des histones (Zhang et al., 2013; Fig. 26b).

Dans le disque imaginal de l’aile, Ci s’exprime uniquement dans le compartiment antérieur. L’utilisation de l’anticorps 2A1 qui reconnait la parte C-terminale de Ci permet de décrire le profil d’expression très caractéristique de Ci (Slusarski et al., 1995; Fig. 26c). Ci-Act s’exprime dans 2 à 3 rangées de cellules proches de la frontière A/P, là où la quantité d’Hh est maximale. Cette forme de Ci est très peu détectée avec l’anticorps Ci2A1, et cette diminution d’immunodétection peut être interprétée, soit par une faible présence du Ci-Act, ou bien par une modification de sa nature biochimque ou structurale qui affecterait sa reconnaissance par l’anticorps 2A1. Ci-Act est cependant visualisable avec un anticorps dirigé contre l’extrémité N-terminale de Ci (Aza-Blanc et al., 1997), favorisant la seconde explication. Ci-155 s’exprime, sous forme d’un plateau dans quatre à cinq rangées de cellules, situées juste après Ci-Act vers la région antérieure du compartiment, qui reçoivent des doses intermédiaires ou faibles d’Hh. Enfin le Ci-Rep se trouve dans les cellules qui ne reçoivent pas d’Hh, localisées loin dans l’antérieur, et n’est pas reconnu par l’anticorps 2A1. Ceci s’explique par le fait que Ci-Rep ne possède pas de région C-terminale, domaine ciblé par l’anticorps. Ce profil différentiel d’expression des formes de Ci, révélé par cet anticorps, indique que l’activité de Ci est dépendante de la quantité de signal Hh perçue par les cellules (Fig. 26d). L’effet d’Hh sur ces différentes formes de Ci a été démontré par l’utilisation de mutants de composants de la voie Hh (Methot et Basler, 1999). Dans les mutants Smo, la quantité de Ci-155 diminue au profit du Ci-Rep, démontrant un clivage constitutif de Ci en absence d’Hh. L’analyse de mutants pour Ptc, montre une stabilisation de Ci-155, et Ci-Act, ainsi qu’une l’activation des gènes cibles, indiquant une activation constitutive de la voie Hh.

Fig. 26 : La régulation de Ci en fonction du signal Hh

a) Représentation schématique de la protéine Ci. De l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale se trouve le domaine de liaison à l’ADN (ZNF : « Zinc Fingers Domain »), le site d’import nucléaire (NLS), le site d’export nucléaire (NES) et le domaine d’activation de la transcription (CBP : « CREB Binding Protein »). Les sites de phosphorylations des différentes kinases agissant sur Ci ainsi que les interactions avec les protéines du complexe de transduction sont indiqués sur le schéma (adaptées à partir de l’HDR de Laurent Ruel).

b) Ci-Rep, Ci-155 et Ci-Act peuvent interagir avec l’ADN par le domaine ZNF, mais ont des fonctions opposées. Ci-Rep empêche la polymérase II et ces co-activateurs d’effectuer la transcription, mais s’associe à un de ses co-répresseurs identifié (Atrophin-Rpd3) afin d’entrainer la fermeture de la chromatine conduisant à l’inhibition de la transcription de ses gènes cibles (1). Ci-155 et Ci-Act recrutent la polymérase II qui est associée à la machinerie de transcription par le domaine CBP. Cette association permet au complexe d’agir en synergie avec les co-activateurs de la transcription qui induisent l’ouverture de la chromatine, facilitant ainsi la transcription des gènes cibles de Ci (2) (modifiée à partir de Müller et Basler, 2000)

c) Disques imaginaux d’ailes sauvages immunomarqués avec Hh ou Ci (2A1). Hh est sécrété par les cellules du compartiment postérieur, et agit sous forme de gradient dans les cellules du compartiment antérieur. Le gradient d’Hh est corrélé avec l’expression des différentes isoformes de Ci. Les formes Ci-Act (proche de l’A/P) et Ci-Rep (domaine où Hh est absent) ne sont pas reconnues par l’anticorps 2A1, alors que l’anticorps 2A1 reconnait la forme Ci-155 situé dans la zone où les cellules recoivent des niveaux intermédiaires d’Hh. Cet outil est très utile pour visualiser et quantifier le degré de signalisation Hh dans différents contextes génétiques.

d) Les trois isoformes de Ci s’expriment dans trois zones le long de l’axe antéro-postéieur, qui correspondent à des niveaux d’Hh différents. Le signal Hh est produit dans le compartiment postérieur, et diffuse selon un gradient de concentration dans le compartiment antérieur (reflète l’immunomarquage d’Hh en C.1. Les niveaux d’expression des protéines Ci-Rep (violet), Ci-155 (vert et Ci-Act (rouge) varient également le long de l’axe antéro-postérieur (modifiée à partir de Wang et Holmgren, 1999).