1.2.1 Le rôle de Gprk2 dans l’activation de Fu pour des hauts niveaux d’Hh
La protéine Gprk2 a été impliquée dans la régulation des hauts niveaux d’Hh. En effet, dans des mutants « perte de fonction » de gprk2, l’expression des gènes caractéristiques des hauts niveaux d’Hh est abolie alors que l’activité des gènes cibles représentatifs des niveaux intermédiaires d’Hh (Molnar et al., 2007), ainsi que la phosphorylation de Cos2 sur la sérine 572 ne sont pas affectées (Ranieri et al., 2012). Nos expériences de BiFC sont en accord avec la littérature puisque la présence de Gprk2 favorise l’association et la localisation membranaire du complexe Smo/Fu, indiquant une activation plus importante de la voie Hh (manuscrit ; Fig. 4d-d’’’ et i). Cet effet de Gprk2 passe par deux mécanismes distincts (Chen et al. 2010) : un mécanisme dépendant de son activité kinase (Molnar et al., 2007 ; Cheng et al., 2010) et un mécanisme indépendant de sa fonction de kinase, via son action sur les Pi4Ps (Jiang et al., 2016). Etant donné le rôle de SmoFu dans l’expression des gènes activés pour de fortes doses d’Hh, nous avons regardé si l’action de ce peptide est dépendante de la présence et de l’une ou l’autre des activités de Gprk2. Dans la figure 3, nous avons montré que l’activation ectopique de la voie Hh causée par l’expression de SmoFu est perdue en absence de Gprk2 (manuscrit ; Fig. 3e’et f’). Ce phénotype est également observé quand on réintroduit dans un contexte mutant « perte de fonction » pour gprk2, soit une forme dépourvue d’activité kinase de Gprk2 (manuscrit ; Gprk2KD ; Suppl. Fig. 3e’’) soit une forme incapable de se lier au Pi4P (manuscrit ; Gprk2ΔC ; donnée non montrée), alors qu’une forme sauvage de Gprk2 sauve ce phénotype. Ces résultats indiquent que la fonction des derniers 52 acides aminés de Smo nécessite la présence d’une protéine Gprk2 possédant toutes ses capacités.
Comment interpréter le besoin de Gprk2 pour l’effet de l’extrémité C-terminale de la queue cytoplasmique de Smo ? Sachant l’importance de Fu dans l’activation de la voie pour des hauts niveaux d’Hh, il est possible que Gprk2 agisse sur Fu afin de rendre celle-ci apte à interagir avec les 52 derniers acides aminés de Smo. De manière intéressante, nous avons observé une interaction entre Fu et Gprk2 qui est augmentée en présence de Smo et d’Hh (manuscrit ; Fig. 4, panneau du bas, j et k), indiquant la formation d’un complexe ternaire entre ces protéines. A cela, s’ajoute un essai de co-immunoprécipitation qui révèle une
interaction directe entre Gprk2 et SmoFu avec le domaine régulateur de Fu. De même, nos
expériences en BiFC montrent que SmoFu induit des changements d’intensité YFP entre Fu et
Gprk2 alors que ces deux protéines restent associées de façon constitutive. Ainsi, en raison de ces différentes expériences, nous proposons que la fixation de SmoFu au domaine régulateur de Fu induit un changement de conformation entre Gprk2 et Fu conduisant à une activation renforcée de Fu (Fig. 48).
Nos résultats suggèrent qu’une association directe entre Gprk2, Fu, et Smo semble être cruciale pour la transmission des fortes quantités d’Hh. De plus, nos données révèlent
une nouveauté : une interaction constitutive entre Fu et Gprk2. Cet aspect sera discuté dans le chapitre suivant.
1.2.2 L’identification d’un nouveau rôle du complexe Fu/Cos2 dans l’activation de Smo par Gprk2
L’analyse des expériences de BiFC in vitro et des immunomarquages des disques imaginaux avec Kinco, forme recombinante de Cos2, a apporté une nouvelle information qui n’avait jamais été documentée auparavant : la présence d’une interaction constitutive entre Fu et Gprk2. En effet, en exprimant Kinco, nous avons vu que Gprk2 forme un complexe avec Fu et Ci dans un contexte mutant pour smo, mimant ainsi l’absence d’Hh (manuscrit ; Suppl. Fig. 5b-b’’’). Ceci suggère que Gprk2 s’associe de façon préférentielle au complexe Fu/Cos2, alors que dans la littérature, la protéine Gprk2 est décrite comme une kinase qui interagit avec Smo pour activer les gènes cibles présents pour de fortes doses d’Hh. Pour renforcer nos données, nous avons procédé à des immunoprécipitations, et confirmé l’interaction directe et constitutive de Gprk2 à Fu (manuscrit ; Fig. 5c). De plus, grâce à des expériences similaires, mais en jouant sur l’absence de l’une ou l’autre des protéines Smo, Fu ou Cos2, nous avons pu démontrer que Gprk2 interagit avec Fu, en particulier sur le domaine régulateur de Fu, et non pas avec Cos2.
Cette découverte, alliée à nos expériences de BiFC, nous permet de proposer un autre modèle concernant l’activation à hauts niveaux d’Hh de Smo par Gprk2. Ranieri, en 2014, a démontré que la PKA est associée au complexe Fu/Cos2, et que ce complexe participe à la phosphorylation et l’activation de Smo. Nos données actuelles montrent que ce même complexe rapproche la kinase Gprk2 de Smo afin de permettre son hyper- activation qui est caractéristique des fortes concentrations du morphogène Hh. Ainsi, dans notre modèle, quel que soit son rôle négatif ou positif, l’une des fonctions du complexe PKA/Gprk2/Fu/Cos2 est d’apporter les kinases PKA et Gprk2 à proximité de leurs substrats Smo ou Ci pour l’activer par phosphorylation. En présence d’Hh, la protéine Smo est stabilisée et incorporée dans le complexe (Lum et al., 2003 ; Ruel et al., 2003), facilitant le rapprochement et l’interaction entre Smo et les protéines PKA et Gprk2. L’étape suivante vise à comprendre comment s’effectue l’activation différentielle de Smo au sein d’un même complexe PKA/Gprk2/Fu/Cos2. Nous savons que pour des hauts niveaux d’Hh, Gprk2 est capable d’activer Smo via un mécanisme dépendant de son activité kinase et un mécanisme indépendant, qui met en jeu les Pi4Ps (Jiang et al., 2016). Cependant, le mécanisme par lequel Gprk2 est activé n’est pas documenté. Une hypothèse envisageable est que les Pi4Ps soient responsable de l’activation de la kinase Gprk2 afin de conduire à la formation du complexe hyper-actif. L’étude de Yavari et al., 2010 vient renforcer cette idée, puisque les auteurs ont montré que la présence d’Hh est responsable d’une augmentation de la concentration intracellulaire de Pi4Ps permettant ainsi l’activation de Smo, mais révélant surtout que Gprk2 se trouve dans un environnement riche en Pi4Ps. De plus, une publication de Ziemba et al., 2013 a révélé un mécanisme dans lequel les « phosphatidylinositol-3,4-5- trisphosphate » (PIP3) sont capables d’activer la « Phosphoinositide-Dependent Kinase-1 »
(PDK1) via leur liaison au domaine PH de cette dernière. En effet, dans leurs travaux, les chercheurs ont montré que la phosphorylation du domaine PH de la PDK1 modifie l’affinité des PiP3s pour ce domaine, ce qui a pour conséquence la transition d’une forme dimérique à une forme monomérique de la PDK1, forme associée à l’activation de la kinase.
Un processus similaire pourrait être imaginé pour Gprk2, sauf que les Pi4Ps seraient ici responsables de l’activation de Gprk2, probablement en entrainant sa dimérisation qui a été montrée comme essentielle dans la formation de l’état hyper-activé de Smo (Chen et al., 2010). Un autre rôle des Pi4Ps, en plus de leur fonction hypothétique sur l’activation de la kinase Gprk2, pourrait être de favoriser l’action d’une protéine Gprk2 déjà fonctionnelle, en démasquant des sites de phosphorylation de cette dernière sur Smo. Ceci est appuyé par le fait que les Pi4Ps et Gprk2 se concentrent dans la même région de Smo. En effet, en 2016, Jiang et al., ont montré que les Pi4Ps se lient à Smo dans le domaine arginine aux alentours des acides aminés situés en position 730, zone qui a été préalablement identifiée comme lieu d’interaction avec Gprk2 (Chen et al., 2010). Ainsi, dans ce micro-domaine, la liaison des Pi4Ps à Smo pourrait entrainer des modifications conformationnelles de sa structure, laissant apparaitre les sites de phosphorylations de la kinase Gprk2 comme la sérine 741 ou la thréonine 742 (Li et al., 2012 ; Fig. 21). Des analyses plus poussées sur la relation entre les Pi4Ps, Smo et Gprk2 devront être faites pour mieux comprendre le rôle des Pi4Ps dans l’activation différentielle de Smo au sein du complexe PKA/Gprk2/Fu/Cos2.