La dégradation de Smo en absence d’Hh

En absence d’Hh, Ptc inhibe Smo par différents processus décrits dans la section 2.2.1.2, conduisant à la dégradation de Smo. Jusqu’à présent, peu de choses étaient connues sur la dégradation de Smo, mais de récentes publications permettent de mieux comprendre la régulation de Smo en absence d’Hh. Plusieurs observations indiquent que la localisation membranaire de Smo est régulée par la voie endocytique. En effet, dans les cellules des glandes salivaires, le blocage de l’endocytose provoque l’accumulation de Smo à la membrane plasmique (Zhu et al., 2003). De plus, grâce à des expériences de recyclage en cellules, l’équipe de Jia et al., 2004 a montré que Smo peut aller à la surface des cellules, mais rapidement internalisée en absence d’Hh, alors que la présence d’Hh diminue ce processus d’internalisation permettant l’accumulation de Smo à la membrane plasmique. Cependant, les mécanismes qui régulent l’adressage de Smo aux endosomes ou à la surface des cellules n’étaient pas décrits jusqu’à l’étude de Li et al., 2012. Beaucoup de récepteurs membranaires, comme les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs), sont internalisés dans les endosomes, puis dégradés par les lysosomes suite à une ubiquitination. Etant donné la ressemblance structurale entre Smo et les GPCRs, les auteurs ont cherché à savoir si la régulation de Smo était similaire à celle des GPCRs. Tout d’abord, ils ont généré des clones mutants pour uba1 (« Ubiquitin-activating enzyme (E1) »), une ubiquitine ligase identifiée chez la drosophile, et démontre que Smo s’accumule dans ces clones. Puis, ils ont également observé une stabilisation de Smo à la surface de cellules de clones mutants pour hrs (« HGF- regulated tyrosine kinase substrate », composante du complexe ESCRT-0), protéine impliquée dans le processus d’endocytose. Des expériences plus poussées indiquent que les

protéines Smo internalisées sont redirigées à la fois au protéasome et aux lysosomes pour leur dégradation complète. Ces résultats montrent que la régulation de Smo est semblable à celle des GPCRs. Ainsi en absence d’Hh, la protéine Smo est ubiquitinylée, internalisée dans des endosomes puis dégradée par le protéasome et les lysosomes. Par des expériences de mutagénèse, ils ont pu démontrer que la plupart des lysines ubiquitinylées se trouvent entre les positions 661 et 818 de Smo, qui est le domaine SAID, défini comme une région auto- inhibitrice (Zhao et al., 2007). Ce domaine est suffisant pour induire l’internalisation et l’adressage aux endosomes puisqu’une protéine chimérique contenant uniquement le domaine SAID fusionné à la partie C-teminale du récepteur de wingless, Frizzled, est internalisée (Fig. 20).

En 2007, Zhao et al., se sont intéressés à une autre protéine, Krutz (Krz), qui est une β- arrestine. Cette protéine agit en parallèle de l’ubiquitination de Smo en favorisant son internalisation. Le rôle de Krz a également été validé par une autre équipe qui montre que la surexpression de Krz induit l’internalisation et la dégradation de Smo in vitro (Molnar et al., 2011). Une autre étude menée par Yang et al., en 2013 a montré que la protéine Vps36 (« Vacuolar protein sorting 36 »), composante du complexe ESCRT-II, est impliquée dans la dégradation de Smo. In vivo, l’absence de Vps36 entraine une augmentation globale de la protéine Smo, et par conséquent l’activation de gènes cibles comme dpp, indiquant que Vps36 est important pour la régulation de Smo en absence d’Hh. Une conséquence de la perte de Vps36 est l’accumulation de Smo dans des endosomes intracellulaires, suggérant un rôle de Vps36 dans le trafic de Smo. Grâce à des expériences de co-immunoprécipitation, les auteurs ont montré que Vps36 se lie à Smo uniquement en absence d’Hh. Cette interaction est dépendante de l’état de phosphorylation de Smo, puisqu’une forme de Smo non phosphorylée se lie à Vps36, alors qu’une forme constamment phosphorylée est incapable d’interagir avec Vps36. De plus, une forme de Smo ubiquitinylée est capable de se lier avec Vps36, et l’addition d’UBPY/USP8 (« Ubiquitin Specific Peptidase 8 »), déubiquitinase qui régule l’état ubiquitinylé de Smo en absence et présence d’Hh (Li et al., 2012), réduit l’interaction entre Smo et Vps36, confirmant l’idée que Vps36 interagit avec Smo via une molécule d’ubiquitine en absence d’Hh. Des mutants de Smo sur les lysines ubiquitinylées, situées essentiellement dans sa queue cytoplasmique, entrainent une localisation membranaire de Smo in vitro, ainsi qu’une activation de la voie Hh in vivo, visible par une expression aberrante de dpp. Ces données montrent qu’en absence d’Hh, Vps36 contrôle le trafic de Smo entre le cytoplasme et la membrane plasmique ainsi que la stabilité et l’activation de Smo.

L’analyse de ces publications indique qu’en absence d’Hh, Smo est ubiquitinylée par Uba1, conduisant à son internalisation, et ce processus est médié par Krz, Hrs et Vps36. Une fois dans les endosomes, Smo est ensuite dégradée par le protéasome et les lysosomes (Fig.20).

Fig. 20 : La dégradation de Smo en absence d’Hh.

En absence d’Hh, Ptc inhibe Smo. Smo est alors ubiquitinylée par uba1. Cet état d’ubiquitination de Smo est finement contrôlé par la déubiquitinase qui a été montré comme agissant en absence d’Hh. Krz, Vps36 et HRS interagissent avec une forme de Smo ubiquitinylée, et régulent son internalisation et son adressage vers les endosomes (adaptée à partir de Li et al., 2012).

La présence d’Hh va agir sur ces différentes étapes afin de permettre une localisation membranaire de Smo qui est nécessaire à son activation. Un paragraphe sera consacré à la régulation de Smo via l’inhibition des mécanismes conduisant à sa dégradation dans le chapitre suivant.