L’activité PLD cellulaire peut être régulée en réponse à une stimulation par des signaux extracellulaires tels que certaines hormones, neurotransmetteurs ou facteurs de croissance (Exton, 2000 ; Rizzo et Romero, 2002). Un grand nombre d’agonistes sont ainsi connus comme
Figure 24 : Modèle illustrant les différences de localisation de la PLD1 selon le type cellulaire et son cyclage entre les compartiments membranaires
(Du et al., 2003)
Dans les cellules COS-7, la PLD1 est localisée au niveau de vésicules cytosoliques et est recrutée en périphérie suite à une stimulation, alors que dans les cellules neurosécrétrices PC12, elle est constitutivement retrouvée à la membrane plasmique et est recrutée au niveau des sites d’exocytose après une dépolarisation. Les interactions de la PLD1 avec les domaines membranaires sont médiées par certains de ses domaines régulateurs. Dans les deux cas, l’interaction du motif polybasique au niveau du cœur catalytique de la PLD avec le PI(4,5)P2 est indispensable à sa localisation à la membrane plasmique. La localisation au niveau des microdomaines lipidiques (rafts) nécessite la palmitoylation de résidus du domaine PH. Dans les cellules COS-7, le domaine PX interagit en parallèle avec le PI5P des endosomes, ce qui facilite la translocation de la PLD1 sur ces vésicules.
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63 activateurs de la PLD, et parmi ceux-ci plusieurs agissent en se liant à des RCPG ou bien à des récepteurs tyrosine kinase (RTK). La liaison des agonistes à leurs récepteurs initie alors des voies de transduction du signal aboutissant à l’activation des PLD et à l’hydrolyse de la PC en PA au niveau du feuillet cytosolique (figure 25A).
La régulation intracellulaire de l’activité des PLD est complexe, mettant en jeu une multitude de régulateurs, et diffère selon le type de stimulus ou de réponse cellulaire. De nombreuses études ont tenté d’identifier les activateurs des PLD, permettant la mise en évidence du rôle clé joué entre autres par les PIP comme le PI(4,5)P2, des protéines kinases et des petites GTPases des familles Arf, Rho et Ras dans divers processus. À l’opposé, d’autres facteurs comme certaines protéines du cytosquelette ou les céramides sont capables d’inhiber l'activité des PLD. La structure primaire des PLD nous renseigne sur les possibilités de régulation par ces protéines ou phospholipides membranaires.
Le niveau de régulation de la PLD dépend particulièrement de l’isoforme considérée. De manière générale et jusqu’à très récemment, il était admis que l’activité de la PLD2 constitue un apport plus important en PA que celle de la PLD1 dans des cellules au repos, et que ce rapport s’inverse après la stimulation des cellules. La PLD1 est en effet caractérisée par une activité basale faible qui peut être stimulée par trois classes d’effecteurs majoritaires : les protéines G de la famille Arf, celles de la famille Rho, ainsi que plusieurs protéines kinases dont la famille des PKC. Lorsque la PLD1 est stimulée simultanément par plusieurs protéines activatrices, la réponse combinée est plus importante que la somme des réponses obtenues individuellement pour chacune. Ces données suggèrent que ces différentes classes d’activateurs interagissent avec des sites de régulation allostérique de la PLD1 distincts, pouvant ainsi moduler différents paramètres cinétiques de son activité enzymatique (Hammond et al., 1997). Bien que tous les domaines de liaison aux régulateurs des PLD n’aient pas été déterminés précisément, des études de mutagenèse ont pu montrer notamment que la partie N-ter de la PLD est importante pour sa régulation par la PKC tandis que la partie C-ter permet la régulation par les GTPases de type Rho et Arf (figure 25B). De plus, l’activation synergique de la PLD1 est dépendante de la concentration de PI(4,5)P2, lequel potentialise l’effet des différents activateurs protéiques (Henage et al., 2006). Contrairement à la PLD1, la PLD2 a une activité basale élevée qui a été décrite dans un premier temps comme peu ou pas régulée par les protéines activatrices de la PLD1 (Colley et al., 1997b ; Kodaki et Yamashita, 1997; Lopez et al., 1998). Toutefois ces données ont été remises en question par plusieurs études plus récentes ayant rapporté une modulation de l’activité de la PLD2 par les protéines Arf (Kim et al., 2003 ; Hiroyama et Exton, 2005 ; Rankovic et al., 2009) et par Rac2 (Peng et al., 2011). Un certain nombre de protéines du cytosquelette inhibant la forte activité basale de la PLD2 ont également été identifiées (Park et al., 2000 ; Lee et al., 2001 ; Chae
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Effet du calcium
Des expériences réalisées in vitro à partir de PLD partiellement purifiée provenant de cerveau de rat ou de poumon de porc ont permis de montrer que le calcium n’est pas nécessaire
Figure 25 : Les voies d’activation des PLD1 et PLD2
A) Principales voies de signalisation cellulaires en amont de l’activation des PLD (Adapté de Frohman, 2015)
Après la stimulation des cellules par certains agonistes ciblant des RCPG ou des RTK, plusieurs voies de transduction du signal se mettent en place, aboutissant notamment à la production de PA par les PLD1 et PLD2. Les principaux activateurs des PLD sont représentés ici : les GTPases monomériques (de type Rho, Ral et Arf), les PKC, ainsi que les RTK directement.
B) Sites de régulation identifiés sur la structure de la PLD1
La PKCα peut réguler l’activité de la PLD1 par une phosphorylation sur l’extrémité N-ter, mais également sur le domaine PH. Un site de phosphorylation par la kinase RSK2 a été décrit sur la thréonine 147 de la PLD1, qui agit sur son activité. Enfin, les GTPases des familles Rho et Arf peuvent interagir avec la PLD1 au niveau de son extrémité C-ter.
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65 à l’activité PLD mais peut tout de même la stimuler (Taki et Kanfer, 1979 ; Okamura et Yamashita, 1994).L’implication de ce cation dans l’activation de la PLD a ensuite été montrée dans des cellules intactes, grâce à l’utilisation d’une part d’ionophores tels que l’ionomycine et l’A23187, qui permettent l’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, et d’autre part de chélateurs du calcium extracellulaire ou intracellulaire, respectivement l’EGTA et le BAPTA. Dans certains modèles comme les hépatocytes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales MDCK ou les fibroblastes stimulés à l’EGF (epidermal growth factor), il existe une activité PLD indépendante du calcium (Bocckino et al., 1987 ; Martin, 1988 ; Cook et Wakelam, 1992 ; Huang
et al., 1992). En revanche, l’ionomycine et l’A23187 stimulent la PLD dans de nombreux types cellulaires(Agwu et al., 1989 ; Anthes et al., 1989 ; Billah et al., 1989 ; Reinhold et al., 1990 ; Huang
et al., 1991), alors que les chélateurs de calcium inhibent l’activation de la PLD par différents agonistes (Pai et al., 1988 ; Kessels et al., 1991 ; Garcia et al., 1992). Ces études suggèrent que la PLD peut être activée soit par la libération de calcium du RE, soit par un apport de calcium extracellulaire, ou bien par les deux mécanismes selon le type cellulaire et l’isoforme de PLD considérés.
Les PLD des mammifères n’ont aucun domaine connu permettant leur association directe au calcium (Liscovitch et al., 2000). De plus, l’activité de la PLD1 recombinante est insensible à l’augmentation de la concentration de calcium in vitro (Hammond et al., 1997). Le calcium semble ainsi activer les PLD de façon indirecte par l’intermédiaire d’autres protéines, comme la calmoduline via son interaction avec les GTPases Arf (Takahashi et al., 1996), les isoformes de PKC dépendantes du calcium ou encore les tyrosine kinases (Earp et al., 1995 ; Yu et al., 1996 ; Ito et
al., 1997).
La boucle de régulation PI(4,5)P2 -PA
Activation de la PLD par le PI(4,5)P2
Les PIP sont des médiateurs importants pour la régulation de l’activité et la localisation subcellulaire des PLD, en particulier parce que leur distribution semble servir de marqueur des compartiments intracellulaires (Oude Weernink et al., 2007). Comme mentionné précédemment, les activités des PLD1 et PLD2 nécessitent la présence de PI(4,5)P2, pour lequel un domaine de liaison différent des domaines PH classiques a été identifié au niveau du site actif de ces enzymes (Colley et al., 1997a ; Hammond et al., 1997 ; Sciorra et al., 1999). Les premières expériences visant à étudier l’importance du PI(4,5)P2 dans l’activation de la PLD ont été réalisées sur des vésicules artificielles de PC/PE ± PI(4,5)P2 mises en présence de PLD recombinante ou purifiée à partir de cerveau de ratpar exemple. Ces études ont permis de constater que le PI(4,5)P2 est un cofacteur nécessaire à l’effet stimulant de la PKC et des petites protéines G des familles Arf et Rho sur la PLD (Brown et al., 1993 ; Liscovitch et al., 1994 ; Massenburg et al., 1994 ; Brown et al., 1995 ; Kuribara et al., 1995 ; Ohguchi et al., 1996 ; Hammond et al., 1997). La stimulation de la
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PLD par le PI(4,5)P2 a été observée de façon dose-dépendante, alors que le PI, le PA et la PS ne semblent pas avoir d’effet sur l’activité de la PLD. Dans les cellules U937, le blocage de la synthèse de PI(4,5)P2 grâce à des anticorps dirigés contre la PI4P5K inhibe complètement l’activité PLD stimulable par le GTPγS (Pertile et al., 1995). De même, l’utilisation de la néomycine, un antibiotique capable de fixer le PI(4,5)P2 avec une grande affinité, entraîne une inhibition de l’activité PLD dans les cellules neuronales, les cellules HL60 et les neutrophiles (Liscovitch et al., 1991 ; Geny et Cockcroft, 1992 ; Ohguchi et al., 1996).
Activation de la PI4P5K par le PA
De façon intéressante, le PA produit par la PLD est capable de réguler positivement la production de PI(4,5)P2 en activant la PI4P5K, l’une des enzymes responsables de la production de ce phosphoinositide. Il existe trois isoformes de PI4P5K chez les mammifères (α, β et γ), qui ont été retrouvées localisées dans la membrane plasmique, au niveau de protrusions membranaires appelées « ruffles » et des adhésions focales, mais aussi sur des compartiments membranaires intracellulaires tels que l’appareil de Golgi, les lysosomes et le noyau (Hinchliffe et
al., 1998). Plusieurs études ont montré que les PI4P5K sont activées par le PA in vitro et in vivo (Divecha et al., 2000 ; Jones et al., 2000). Cet effet est obtenu aussi bien avec du PA exogène qu’avec du PA endogène formé par la PLD (Moritz et al., 1992). De plus, le PA stimule spécifiquement la PI4P5K par rapport à la PI5P 4-kinase (PI5P4K), une PIP kinase de type II qui catalyse la production de PI(4,5)P2 à partir du PI5P. Cette activation est médiée par une liaison du PA sur l’extrémité C-ter de la PI4P5K, qui augmente ainsi son affinité pour son substrat (Jenkins et al., 1994 ; Ktistakis et al., 2003). Ainsi, la synthèse de PI(4,5)P2 est amplifiée après l’activation de la PLD par Arf et la formation de PA dans les membranes des cellules HL60 (Fensome et al., 1996). À l’inverse, l’inhibition de la PLD avec des alcools primaires bloque la synthèse de PI(4,5)P2 dans les membranes lysosomales, suggérant un contrôle de la production de ce lipide par le PA (Arneson et al., 1999). Il est aussi important de noter que les PLD1 et PLD2 semblent interagir directement avec la PI4P5K. La PLD2 est notamment capable de recruter cette kinase à la membrane (Divecha et al., 2000). L’activité de la PI4P5K peut également être stimulée par les GTPases Arf et notamment Arf6, un des activateurs principaux de la PLD (Honda et al., 1999 ; Jones
et al., 1999 ; Perez-Mansilla et al., 2006).
L'augmentation de la concentration intracellulaire de PI(4,5)P2 stimulant à son tour la PLD, il existe alors une étroite relation entre la PLD, la PI4P5K et leurs produits respectifs. Il semble que la PLD et ses régulateurs protéiques puissent agir dans une boucle de rétrocontrôle positif pour activer la PI4P5K, afin de produire du PI(4,5)P2 à la membrane plasmique qui lui-même va augmenter l’activité PLD. Ce dispositif d’amplification, permettant une accumulation localisée massive de PA et PI(4,5)P2, pourrait jouer un rôle physiologique important. Par ailleurs, la production de PI(4,5)P2 par la PI4P5K a été impliquée dans l’exocytose, la phagocytose, et la
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67 régulation du cytosquelette d’actine (Hinchliffe et al., 1998). Ces fonctions cellulaires étant également régulées par le PA, cela amène à penser que ce dernier puisse en partie agir de manière indirecte en tant que cofacteur de la PI4P5K.
Protéines kinases
Les kinases sont des enzymes capables d’utiliser l’ATP pour phosphoryler les résidus tyrosines de certaines protéines, ou bien les résidus sérines/thréonines dans le cas de la famille des PKC. Ces phosphorylations provoquent des modifications des protéines cibles impliquées dans la transduction des signaux, en induisant un changement de leur conformation.
La famille des PKC
Les PKC sont des sérine/thréonine kinases, qui possèdent un domaine de liaison avec les lipides acides tels que la PS (Hug et Sarre, 1993).Les isoformes de PKC peuvent être divisées en trois sous-familles selon leur mode d’activation : les PKC conventionnelles (α, β et γ) activables par le calcium, le DAG et la PS ; les PKC nouvelles (δ, ε, η, θ) activables par le DAG et la PS mais indépendantes du calcium ; et les PKC atypiques (ζ, λ, et ι) activables seulement par la PS.
L’activation de la PLD par les PKC a été démontrée dans de nombreux types cellulaires, dans un premier temps en utilisant des esters de phorbol tels que le PMA (phorbol myristate acetate), un activateur classique des PKC conventionnelles et nouvelles. Le PMA agit selon un mécanisme similaire au DAG, en entraînant la translocation membranaire des PKC. Cependant, un traitement prolongé par le PMA provoque la dégradation des PKC selon un mécanisme de rétrocontrôle négatif (Lopez et al., 1995). Le lien entre la PLD1 et la PKC a été établi par le fait que la stimulation avec le PMA de cellules COS-7 surexprimant la PLD1 augmente l’activité PLD (Colley
et al., 1997b). De plus, des expériences d’immunoprécipitation ont permis de constater que le traitement de fibroblastes NIH 3T3 par le PMA induit l’association de la PLD1 avec la PKCα (Lee
et al., 1997a). La dégradation des PKC suite à un traitement prolongé des cellules avec le PMA a pour effet de supprimer la capacité de divers agonistes à stimuler la PLD. Néanmoins, dans certains cas, le rétrocontrôle négatif des PKC ne provoque qu’une inhibition incomplète voire nulle de la stimulation de la PLD, ce qui a suggéré la présence de régulateurs de l’activité PLD indépendants des PKC (Exton, 1997).
D’autres approches ont validé ensuite ces premières observations. L’utilisation d’inhibiteurs des PKC par exemple (Davis et al., 1989) bloque partiellement ou totalement l’activation de la PLD par certains agonistes (Bosch et al., 1999 ; Khan et Hichami, 1999 ; Slaaby et
al., 2000). Des expériences ont également permis de définir les rôles spécifiques des PKCα et β dans l’activation des PLD
.
La surexpression de ces deux isoformes dans des fibroblastes augmente l’activité PLD basale ainsi que l’activité stimulée par l’endothéline, la thrombine et le PDGF (platelet-derived growth factor) (Pai et al., 1991 ; Pachter et al., 1992 ; Eldar et al., 1993). ÀIntroduction générale | Les phospholipases D
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l’inverse, l’altération de l’expression de la PKCα par des ARN interférents dans les cellules MDCK diminue l’activation de la PLD par les agonistes purinergiques (Balboa et al., 1994). Cette activation de la PLD1 par une PKC est synergique avec celle induite par les petites protéines G (Singer et al., 1996 ; Hammond et al., 1997) et par le PI(4,5)P2 (Ohguchi et al., 1996). Tous ces résultats indiquent donc que les PKCα et β jouent un rôle important dans la régulation de l’activité PLD. Cependant, le mécanisme d’activation des PLD par les PKC est longtemps resté débattu.
En effet, certaines études ont indiqué que les PKC phosphorylent directement la PLD1 in vivo, sur des résidus identifiés, et que ces phosphorylations régulent l’activité de la PLD1 (Kim et
al., 1999, 2000).La stimulation par le PMA ou l’EGF induit notamment la phosphorylation de PLD1 retrouvée au niveau des microdomaines lipidiques de la membrane plasmique, où elle forme un complexe avec la cavéoline-1 et le récepteur à l’EGF (EGFR). La mutation des sites de phosphorylation réduit l’activité PLD en réponse à l’EGF (Han et al., 2002).Néanmoins, plusieurs études réalisées en parallèle ont montré que l’activation de la PLD1 après ajout de PMA est indépendante de l’activité kinase de la PKCα, puisqu’elle se produit également in vitro en l’absence d’ATP (Singer et al., 1995 ; Hammond et al., 1997 ; Min et al., 1998). Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs de PKC comme la staurosporine ne bloque que partiellement l’activation de la PLD par certains agonistes (Bosch et al., 1999 ; Khan et Hichami, 1999 ; Slaaby et al., 2000). De façon intéressante, le domaine régulateur de la PKC est capable à lui seul de stimuler la PLD (Singer et
al., 1996). De nombreux résultats suggèrent ainsi que l’interaction directe entre la PKCα et la PLD1 soit suffisante pour activer cette dernière (Colley et al., 1997a ; Min et Exton, 1998 ; Kim et al., 1999).
En accord avec ce modèle, des études ont montré par la suite que l’augmentation rapide de l’activité de la PLD1 en réponse au PMA est corrélée avec l’augmentation de l’interaction PLD1-PKCα, et que la phosphorylation de la PLD1 par la PKC n’a lieu que plus tardivement (Hu et Exton, 2003 ; Becker et Hannun, 2005 ; Kook et Exton, 2005). En outre, la surexpression d’un mutant dominant négatif de la PKCα, localisé majoritairement à la membrane plasmique, stimule l’activité PLD plus fortement que la forme sauvage. Le traitement des cellules COS-7 avec la staurosporine réduit partiellement l’interaction entre PLD1 et la PKC induite par le PMA, ce qui peut expliquer la diminution de l’activité PLD en présence de ce type d’inhibiteurs (Hu et Exton, 2003).Cet effet pourrait également être expliqué par une action indirecte sur la phosphorylation d’autres régulateurs de la PLD1 par la PKC. Par exemple, la PKC phosphoryle et inhibe Ras-GAP, conduisant à une activation de Ras qui active d’autres GTPases régulatrices de la PLD1 (Colley et al., 1997b).
Des expériences de mutagénèse dirigée ont montré que la PLD1 interagit directement avec la PKCα via son domaine N-ter (Xie et al., 1998), mais en amont des domaines PH et PX (Hammond
et al., 1997 ; Sung et al., 1999a). Les mutants de PLD1 délétés de leur extrémité N-ter ne voient pas leur activité augmenter après une stimulation aux esters de phorbol (Hodgkin et al., 1999 ;
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Sugars et al., 1999). Cependant des travaux plus récents ont montré que la PKCα peut réguler l’activité de la PLD1 en interagissant avec son domaine PH, ainsi qu’avec son extrémité C-ter au niveau du résidu F663 (Kook et Exton, 2005 ; Hu et Exton, 2005). Du fait de ces différentes interactions, la PKC semble induire un changement conformationnel de la PLD1, favorisant l’accès de la PC au niveau de son domaine catalytique (Henage et al., 2006).
La PLD2 quant à elle a été initialement décrite comme insensible aux PKC (Colley et al., 1997b
;
Kodaki et Yamashita, 1997). Cependant, quelques années plus tard, plusieurs études ont décrit une activation de PLD2 en réponse au PMA, quoique d’une amplitude plus faible que celle observée pour PLD1 (Siddiqi et al., 2000 ; Han et al., 2002 ;Chen et Exton, 2004). Dans les cellules PC12, la surexpression d'un mutant de PKCδ dépourvu d'activité kinase ou l’inhibition spécifique de cette isoforme suppriment l'activation et la phosphorylation de PLD2 par les esters de phorbol. Dans ce cas, l'activation de PLD2 par la PKCδ se fait très probablement via une phosphorylation directe (Han et al., 2002). Des expériences ont pu également montrer que la PKCα interagit in vivo avec la PLD2 et l’active suite à une stimulation par le PMA. Cette activation est accompagnée d’une phosphorylation de la PLD2 qui contribue à désactiver l’enzyme, indiquant que l’activation de la PLD2 par la PKCα soit médiée par une interaction protéine-protéine (Chen et Exton, 2004).La protéine RSK2
Parmi les sérine/thréonine kinases qui régulent l’activité PLD, les PKC sont les plus étudiées et les plus ubiquitaires. D’autres enzymes avec cette activité sont retrouvées fortement exprimées dans des tissus plus spécifiques, telles que les membres de la famille RSK (Ribosomal S6 kinase). En effet, le résidu Thr-147 sur le domaine PX de la PLD1, connu pour être phosphorylé par la PKC, se trouve également dans une séquence consensus de phosphorylation pour l’isoforme RSK2. Cette dernière est phosphorylée et activée par ERK1/2 (extracellular-signal-regulated kinase) en réponse à une stimulation extracellulaire par des facteurs de croissance, ainsi que certaines hormones et neurotransmetteurs. Via son activité kinase sur différents substrats cytosoliques et nucléaires, la protéine RSK2 est impliquée dans différents processus cellulaires