Activité enzymatique
Les phospholipases cellulaires
Les phospholipases sont une classe d’enzymes capables d’hydrolyser les phospholipides membranaires. Elles assurent ainsi un remodelage dynamique des membranes, et sont également responsables de la production de médiateurs lipidiques (Darios et al., 2007). Il existe quatre types majeurs de phospholipases cellulaires : la PLA1 (EC 3.1.1.32), la PLA2 (EC 3.1.1.4), la PLC (EC 3.1.4.3) et la PLD (EC 3.1.4.4). Ces différents types possèdent une spécificité de lyse d’une liaison ester au sein du phospholipide (figure 20).
Les PLA1et PLA2hydrolysent la liaison ester des glycérophospholipides en position sn-1 et sn-2 respectivement. Elles produisent ainsi un lysophospholipide membranaire et libèrent un acide gras soluble dans le cytosol. Ces deux enzymes sont responsables de la conversion du PA en LPA, mais également de la production d’acide arachidonique, un acide gras polyinsaturé de type oméga-6. Cet acide gras pourra ensuite servir de précurseur à des médiateurs de type eicosanoïdes jouant un rôle important dans l’inflammation ou l’agrégation plaquettaire (Aoki et
al., 2008 ;Dennis et al., 2011).
La PLC, quant à elle, hydrolyse la liaison phosphodiester proximale des glycérophospholipides, située en position sn-3. Cette enzyme génère alors une molécule de DAG qui reste ancrée dans la membrane et libère le groupement polaire lié au glycérol. Les PAP ont une activité enzymatique similaire mais PA-spécifique. In vivo, les PLC catalysent l’hydrolyse du PI(4,5)P2, le plus souvent suite à l’activation de récepteurs membranaires, et libèrent ainsi une molécule d’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3). Le DAG et l’IP3 sont des seconds messagers importants qui contrôlent diverses voies de signalisation cellulaire. Le DAG néosynthétisé va pouvoir agir sur la courbure membranaire ainsi qu’activer la PKC, tandis que l’IP3 provoque une augmentation de la concentration cytosolique de calcium à partir des réserves du RE (Nakamura et Fukami, 2017).
Enfin, la PLD hydrolyse la liaison phosphodiester distale des phospholipides membranaires. Son action permet ainsi de produire une molécule de PA dans la membrane en libérant dans le cytosol la tête polaire du phospholipide substrat. Les différentes PLD prennent principalement la PC comme substrat, mais elles peuvent également utiliser la PE, le PI ou la CL.
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Réactions enzymatiques catalysées par les PLD
En condition physiologique, c’est-à-dire en milieu aqueux, les PLD catalysent l’hydrolyse des phospholipides via le transfert d’une molécule d’eau à la place du groupement polaire lié au phosphate. Les PLD des mammifères hydrolysent principalement la PC et produisent ainsi du PA dans le feuillet cytosolique de la bicouche, ainsi qu’un produit soluble, la choline (Exton, 2000).
Figure 20 : Réactions enzymatiques catalysées par les différentes phospholipases
A) Sites d’hydrolyse spécifiques des phospholipases
Chacune des phospholipases clive une liaison ester distincte sur le phospholipide. Les PLA1 et PLA2 hydrolysent la liaison en position sn-1 et sn-2, respectivement. La PLC quant à elle hydrolyse la liaison proximale en position sn-3, et la PLD la liaison distale.
B) Production des lipides de signalisation (Adapté de Darios et al., 2007)
L’activité des PLA génère des lysophospholipides ainsi que des acides gras libres. La PLC est responsable de la production de DAG en libérant le groupement polaire phosphoré. Enfin, la PLD produit du PA et de la choline libre dans le cas majoritaire où l’enzyme utilise la PC comme substrat.
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47 Cette activité a été décrite dans des cellules de mammifères en 1975, plus de 30 ans après la première découverte des PLD chez les végétaux. La choline étant une molécule très abondante dans divers tissus et ne possédant pas de rôle de second messager, il est supposé que la fonction de la PLD soit essentiellement médiée par la formation du PA. De façon intéressante, la conversion de la PC en PA permet la formation d’un lipide conique chargé négativement à partir d’un lipide cylindrique neutre, ce qui modifie les propriétés de la membrane au niveau du site d’activité de la PLD en entraînant notamment l’apparition d’une courbure négative (figure 21A).
En plus de la réaction d’hydrolyse, les PLD peuvent également réaliser une transphosphatidylation, qui consiste en l’échange de la tête polaire du phospholipide substrat par
Figure 21 : Réactions enzymatiques catalysées par la PLD
A) Formation du PA par la PLD
En conditions physiologiques, la PLD produit du PA en hydrolysant la liaison phosphodiester distale des glycérophospholipides, avec pour substrat préférentiel la phosphatidylcholine. Cette activité enzymatique spécifique transforme un lipide cylindrique en un lipide conique, dont l’accumulation va créer une courbure négative du feuillet membranaire.
B) Activité de transphosphatidylation en présence d’alcool primaire
En présence d’une faible concentration d’alcools primaires à courte chaîne comme l’éthanol ou le butanol, la PLD catalyse la formation de phosphatidylalcool aux dépens du PA. Cette activité de transphosphatidylation est utilisée comme moyen d’inhiber les fonctions physiologiques des PLD.
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une autre tête polaire (figure 21B). Cette réaction est réalisée en présence d’alcools primaires à chaîne courte, qui sont alors utilisés à la place de l’eau pour cliver la liaison phosphodiester distale, conduisant à la formation du phosphatidylalcool correspondant. Les alcools primaires sont d’excellents accepteurs nucléophiles, possédant une réactivité 1000 fois plus élevée que l’eau.En présence d’une faible concentration d’alcool primaire, on observe donc une formation préférentielle de phosphatidylalcool aux dépens du PA (Yang et al., 1967). Il a été montré que la PLD de membranes de cerveau de rat utilise de manière plus efficace le 1-butanol par rapport au propanol et à l’éthanol (Chalifa-Caspi et al., 1998). Cette réaction a été considérablement utilisée en tant que marqueur de l’activité PLD, mais aussi comme un moyen d’inhiber l’activité de ces enzymes en court-circuitant la formation du PA.
Les PLD1 et PLD2 présentent toutes deux une activité d’hydrolyse et de transphosphatidylation PC-spécifique. Elles partagent également une forte dépendance au PI(4,5)P2, la présence de ce phosphoinositide étant nécessaire à leur activité. Cependant, la PLD2 possède in vitro une activité basale jusqu’à 1500 fois supérieure à celle de la PLD1. Cette activité est considérée historiquement comme peu voire non stimulée par les protéines activatrices de la PLD1 (Frohman et al., 1999), bien que ceci soit remis en question par des observations plus récentes (Ghossoub et al., 2014).
Mécanisme catalytique
Les PLD1 et PLD2 sont composées de deux domaines HKD, qui sont sollicités pour la réaction de transphosphatidylation ou d’hydrolyse. L'analyse d’une série de mutations réalisées dans ces domaines a ensuite permis une meilleure compréhension du mécanisme catalytique de ces enzymes. Ces observations ont permis d’établir un modèle de catalyse théorique mettant en jeu un mécanisme en deux temps de type « ping-pong », car il fait successivement intervenir les deux domaines catalytiques (Sung et al., 1997). Bien que la formation d’un intermédiaire phosphatidyl-enzyme au cours de la réaction de transphosphatidylation ait été mise en évidence très tôt après la découverte des PLD (Yang et al., 1967), le mécanisme catalytique n’a pu être étudié que récemment. La structure tridimensionnelle d’une PLD cristallisée en présence de son substrat a été obtenue pour la première fois chez la bactérie Streptomyces. L’observation de cette structure a confirmé le mécanisme d’action de type « ping-pong », et a également montré que les résidus histidines des deux domaines HKD permettent de coordonner directement la réaction (Leiros et al., 2000). L’implication des différents résidus du motif catalytique HKD a également été étudiée in silico par la modélisation moléculaire dynamique de 19 résidus composant le site actif (DeYonker et Webster, 2013).
L’ensemble de ces études a permis de distinguer 4 étapes successives dans le mécanisme catalytique des PLD1 et PLD2 (figure 22). Après l’adsorption de la PLD à l’interface lipidique, le groupement amine de l’histidine du domaine HKD 1 se lie au phosphate de la PC. Cette 1ère étape
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49 réactionnelle conduit à la formation d’une liaison phosphoramide entre la PLD et la PC, générant ainsi un intermédiaire covalent PLD-PC. La liaison phosphodiester distale de la PC est ensuite clivée par l’attaque nucléophile de l’histidine du domaine HKD 2. Cette 2ème étape permet de libérer la choline et de former un intermédiaire phosphatidyl-PLD. Le nucléophile (molécule d’eau ou d’alcool primaire) est ensuite pris en charge par la PLD, puis le résidu histidine du domaine HKD 2 réalise une oxydation de celui-ci. Cette 3ème étape induit le transfert du second substrat oxydé sur le groupement phosphate libre, afin de former un intermédiaire PLD-phosphatidylalcool ou PLD-PA. La dernière étape de rupture de la liaison phosphoramide instable aboutit à la libération du PA ou du phosphatidylalcool néosynthétisé, ainsi qu’à la régénération du site catalytique de la PLD.
Figure 22 : Mécanisme catalytique des PLD
(Adapté de Selvy et al., 2011)
Les deux domaines HKD participent à la réaction, en impliquant chacun un résidu histidine. Au début du cycle réactionnel (1), le groupement amine en HKD 1 effectue une attaque nucléophile sur la PC, formant ainsi un intermédiaire PLD-PC via une liaison phosphoramide (2). Cette liaison est ensuite rompue par le groupement amine en HKD 2, ce qui libère la choline en établissant un intermédiaire phosphatidyl-PLD. Lorsque le nucléophile est pris en charge par la PLD, il est oxydé par le groupement amine en HKD 2 (3). Cela entraîne son transfert sur le groupement phosphate, conduisant à la formation d’un intermédiaire PLD-PA ou PLD-phosphatidylalcool (4). Enfin, la rupture de la liaison phosphoramide permet de libérer le PA ou phosphatidylalcool néosynthétisé.
R = groupement DAG
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Mesure de l’activité enzymatique des PLD
Plusieurs méthodes ont été décrites pour mesurer l’activité de la PLD dans des cellules intactes ou en système acellulaire. Celles-ci sont généralement basées sur le dosage des produits formés par l’enzyme dans le milieu réactionnel. Initialement, les mesures étaient effectuées par radioactivité, car c’est une des méthodes les plus sensibles et qui présente l’avantage d’être très polyvalente, permettant de doser l’activité PLD aussi bien in vitro que directement sur des cellules en culture. Cette technique a été progressivement délaissée par la suite au vu de ses contraintes techniques importantes et a été supplantée aujourd’hui par des dosages par spectrophotométrie ou spectrofluorimétrie, représentant un bon compromis en termes de simplicité d’utilisation et de sensibilité de détection. La mesure directe du PA présentant des inconvénients non négligeables, l’activité PLD est le plus souvent mesurée de façon indirecte, à travers le dosage soit du produit hydrosoluble libéré durant la réaction, comme la choline, soit de phosphatidylalcool non métabolisable.
Mesure du produit lipidique
La mesure directe de l’activité PLD a été effectuée initialement par la mesure de la radioactivité du PA formé après activation de l’enzyme. Cette méthode emploie des phospholipides substrats marqués par un atome radioactif comme le tritium sur une des chaînes acyles (Huang et Cabot, 1990). Une méthode colorimétrique a également été développée afin de déterminer la spécificité de substrat des PLD. Elle est basée sur le dosage du phosphate inorganique généré par la phosphatase alcaline, suite à la formation de PA par la PLD (Martin et
al., 2000).
Cependant, la mesure totale du PA produit via ces techniques ne reflète pas toujours l’activité PLD, puisque le substrat peut être métabolisé par d’autres phospholipases et ensuite être pris en charge par d’autres enzymes de biosynthèse du PA, notamment les DGK. La spécificité de l’activité PLD ou DGK peut par exemple être discriminée par l’ajout de [32P]ATP, dont la mesure permet de déterminer si le groupement phosphate est nouvellement ajouté ou s’il provient du substrat. Plus récemment, une nouvelle méthode plus spécifique de l’activité PLD et permettant d’évaluer son activité en temps réel a été mise au point. Cette méthode utilise la 8-hydroxyquinoléine, une molécule capable de former un complexe fluorescent avec le groupement phosphate en présence de certains ions métalliques (Rahier et al., 2016).
De plus, le fait que le PA soit très rapidement métabolisé dans la cellule peut entraîner une sous-estimation importante de l’activité PLD. Afin de remédier à cela, le dosage de l’activité de la PLD à partir de cellules ou de tissus a longtemps utilisé la propriété de transphosphatidylation de cette enzyme. Les phosphatidylalcools présentent les avantages de ne pas être métabolisables par les enzymes cellulaires et d’être facilement quantifiables. L’ajout d’alcools primaires en faible concentration dans le milieu réactionnel empêche également toute confusion avec le PA issu du
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51 DAG. C'est donc une méthode de mesure sensible et hautement spécifique de l'activité enzymatique de la PLD (Randall et al., 1990 ; Morris et al., 1997). L’activité de transphosphatidylation est mesurable soit via l’emploi d’un phospholipide contenant un acide gras tritié, soit par l’ajout d’un alcool primaire tritié.
Mesure du produit hydrosoluble
L’activité PLD peut également être mesurée de façon indirecte par dosage de la choline libérée par l’hydrolyse de la PC. La tête polaire de la PC est alors marquée avec de la choline tritiée, dont la radioactivité sera dosée une fois libérée dans le milieu réactionnel. Il est également possible de quantifier la choline par mesure de chimiluminescence (Pedruzzi et al., 1998). Toutefois la mesure de ce groupement polaire présente des limites similaires à celle du PA in cellulo. En effet, la PLC peut lyser le substrat pour former de la phosphocholine, qui peut ensuite être transformée en choline sous l’action d’une phosphatase. De plus, la choline libérée dans des cellules intactes est rapidement phosphorylée pour former du DAG par exemple (Besterman et al., 1986). Ce type de mesure est donc plus adapté à des extraits membranaires ou des vésicules artificielles.
Les tests présentés précédemment présentent l’inconvénient de se fonder sur l’utilisation de substrats synthétiques, empêchant par conséquent l’étude des paramètres cinétiques de la PLD vis-à-vis des substrats naturels. Par ailleurs, les groupements chromophores et fluorophores de ces phospholipides sont composés de cycles aromatiques qui induisent un encombrement stérique important et risquent ainsi d’empêcher une prise en charge optimale par le site actif de l’enzyme. Par la suite, une méthode de dosage des activités PLD fondée sur la quantification de la choline libérée lors de l’hydrolyse de la PC a été développée (Takrama et Taylor, 1991). Dans ce test couplé, la choline libre est prise en charge par la choline oxydase afin de former du peroxyde d’hydrogène, lui-même substrat de la peroxydase. Cette méthode permet finalement de quantifier la production de choline par la PLD, via le dosage de produits finaux chromogéniques ou fluorescents en utilisant la méthode de l’Amplex Red (Zhou et al., 1997). Il est à noter que ce dosage nécessite une activité PLD relativement élevée dans l’échantillon car il présente un signal basal fort dû aux niveaux de choline cellulaire déjà importants en l’absence de toute activité PLD.
Inhibition de l’activité PLD
De nombreux outils ont été utilisés pour étudier les rôles physiologiques des PLD chez les mammifères. Les stratégies classiques d’invalidation de l’enzyme endogène reposent sur la délétion du gène pour créer des modèles PLD1 ou PLD2 KO, l’extinction temporaire de l’expression des PLD par ARN interférence ou encore l’inhibition de l’activité enzymatique. Les deux premières stratégies ont permis de démontrer l’implication des PLD dans de nombreux processus cellulaires (Bruntz et al., 2014a). Cependant l’étude des mécanismes d’action précis du PA requiert un contrôle temporel de l’activation de l’enzyme, qui n’est possible que grâce à
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l’inhibition de son activité à un moment précis. De plus, contrairement à la modification génique, les molécules pharmacologiques sont utilisables de façon simple sur tous les types de cellules incluant les cultures primaires, et potentiellement disponibles en clinique.
Les inhibiteurs chimiques historiques et leurs limites
Comme décrit précédemment, en présence d’alcools primaires, la réaction catalytique des PLD est orientée vers la transphosphatidylation au détriment de l’hydrolyse. Il ne s’agit donc pas à proprement parler d’un mécanisme d’inhibition mais la formation du phosphatidylalcool empêche celle du PA et interfère ainsi avec ses fonctions cellulaires. L’ajout d’alcools primaires comme le 1-butanol ou l’éthanol dans le milieu extracellulaire a ainsi été extrêmement utilisé et est resté longtemps l’unique méthode pour bloquer l’activité de la PLD (Burkhardt et al., 2014a). Cette méthode comporte toutefois une limitation majeure, qui consiste en l’évaluation des éventuels effets aspécifiques de l’alcool. Le plus souvent, un alcool secondaire est utilisé comme contrôle, puisque cette classe n’est pas métabolisable par la PLD. Néanmoins, cela n’exclut pas que l’alcool primaire ait un rôle en lui-même sur des processus cellulaires régulés ou non par les PLD. Les résultats obtenus avec ce type d’inhibition doivent alors être analysés avec une grande précaution. En effet, il existe de nombreuses incertitudes quant aux effets de l’utilisation des alcools primaires sur des cellules en culture, notamment vis-à-vis des effets sur différentes voies de signalisation. Cette méthode s’est avérée d’autant plus discutable lorsque certains résultats obtenus avec des alcools primaires n’ont pas pu être reproduits avec l’utilisation plus récente d’oligonucléotides antisens (siRNA, small interfering RNA) ou d’inhibiteurs pharmacologiques des PLD (Nelson et Frohman, 2015). Une méthode d’inhibition plus spécifique est donc apparue comme nécessaire afin d’obtenir des données plus fiables. Enfin, l’utilisation de 1-butanol ne permet pas de distinguer la fonction spécifique de l’une des isoformes, mais est représentatif de l’activité globale des cellules. Le développement d’inhibiteurs pharmacologiques depuis quelques années a alors représenté une avancée majeure dans la caractérisation biologique des PLD ainsi que dans le développement de nouvelles thérapies (Vitale et al., 2010).
Les inhibiteurs pharmacologiques spécifiques
Des efforts de recherche d’inhibiteurs des PLD ont ainsi conduit depuis la fin des années 1990 à l’identification de plusieurs composés pouvant bloquer l’action de ces enzymes, mais pas toujours de façon directe et spécifique (Selvy et al., 2011). La recherche d’inhibiteurs de PLD a pris un nouveau tournant en 2007 avec l’identification de l’halopémide, une molécule utilisée comme psychotrope, au cours d’un criblage d’inhibiteurs de la hPLD2 effectué par la société Novartis (Monovich et al., 2007). L’halopémide est capable d’inhiber la hPLD2 (IC50 de 310 nM in vitro et de 300 nM in cellulo), mais également la hPLD1 (IC50 de 220 nM in vitro et de 21 nM in cellulo). Un travail d’optimisation de la structure de cet inhibiteur non-sélectif a été entrepris afin de potentialiser son effet (figure 23). Cela a amené à la conception de plusieurs dérivés, dont le
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53 FIPI (5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopémide) qui présente une meilleure efficacité à inhiber les PLD1 (IC50 de 9,5 nM in vitro et 1 nM in cellulo) et PLD2 (IC50 de 17 nM in vitro et de 44 nM in cellulo) (Scott et al., 2009).
Néanmoins, comme le montrent leurs IC50, l’halopémide et le FIPI ne présentent pas de réelle spécificité vis-à-vis d’une isoforme. Ce travail s’est alors poursuivi dans le but de produire des analogues synthétiques de l’halopémide sélectifs vis-à-vis des PLD1 ou 2, non disponibles jusqu’alors. Par exemple, le composé VU0359595 est un inhibiteur sélectif de la PLD1, capable d’inhiber les hPLD1 et hPLD2 avec des IC50 respectives de 3,7 nM et de 6400 nM in vitro, tandis que le VU0285655 est sélectif de la PLD2 puisqu’il présente des IC50 respectives de 1900 nM et de 90 nM pour les hPLD1 et hPLD2 (Scott et al., 2009). Plusieurs molécules analogues ont été synthétisées à partir de celles-ci et commercialisées.
L’utilisation de ces inhibiteurs a permis non seulement de discriminer le rôle cellulaire de chaque isoforme, mais également d’entrevoir une application thérapeutique à ces molécules. En effet, des tests précliniques avec des inhibiteurs de PLD ont révélé des effets encourageants dans différentes pathologies cancéreuses ou infectieuses, en particulier au vu de leur faible toxicité in vivo (Brown et al., 2017). Des essais cliniques de phase 2 sont d’ailleurs actuellement en cours aux Etats-Unis pour le traitement du cancer du sein. Le mécanisme d’action de ces inhibiteurs n’est