Immobilisation des sondes oligonucléotidiques sur support par chimie

Préparation de la solution de sonde à spotter

Pour chaque sonde 25 µL de solution à spotter, contenant la sonde à 10 µM nal, 5 équivalents (eq) de iodure de cuivre et 25 eq de DIPEA, sont préparés comme indiqué ci-dessous :

5.4  Protocoles liés aux biopuces Tampon A Sonde (100 µM) CuI (1 mM) DIPEA (5 mM)

V (µL) 20 2,5 1,25 1,25

Tableau 5.3  Préparation de la solution de sonde à spotter.

Spotting des solutions de sondes

Les solutions sont déposées dans un réservoir de type micro-plaque placée à l'endroit adéquat sur un robot Piezoarray (PerkinElmer). Celui-ci dépose 2 gouttes de 350 pL par spot. Une fois les lames spottées suivant le plan de dépôt souhaité, les blocs sont gravés avec une pointe de diamant. Les lames sont alors placées dans des boîtes à température ambiante, à l'abris de la lumière, pour la nuit. Le lendemain, ces dernières sont lavées dans un bain de SDS 0,2 % pendant 5 minutes, à température ambiante puis dans un bain d'eau milliQ pendant 5 minutes, à température ambiante. Elles sont ensuite séchées par centrifugation 3 minutes à 600 g.

5.4.4 Protocole d'hybridation pour la détection de mismatch sur lames

Un cache auto-adhésif (Grace Bio-Labs) est placé sur chaque lame délimitant les chambres d'incubation (volume d'environ 17 µL) pour les diérents blocs de la lame (gure (5.1)).

Figure 5.1  Incubation des blocs d'une lame fonctionnalisée à l'aide de caches auto-adhésifs. Les chambres d'incubation sont alors remplies avec une solution de cible à 10 nM diluée dans du tampon d'hybridation 1 M et recouvertes d'un lm auto-collant an d'éviter l'évaporation. Les lames sont placées dans une étuve à 37 °C pendant 1 h. Elles sont ensuite lavées avec la solution de lavage à 0,3 M, (5 min à température ambiante) puis avec la solution de lavage à 0,03 M. Elles sont alors séchées par centrifugation (3 min à 600 g). Les lames sont lues à 532 nm avec une résolution de 5 µm sur une scanner Genepix 4200A scanner (Axon Instruments). Le gain du photomultiplicateur est réglé en fonction du signal obtenu de sorte à ne pas saturer le

détecteur. La uorescence des spots est alors quantiée avec le logiciel Genepix Pro 5.1 (Axon Instrument).

5.4.5 Protocole d'hybridation et d'incubation enzymatique pour les lames "hairpins"

Après l'étape de spotting des sondes sur les lames, et une fois ces dernières lavées et séchées, on procède à une étape de ré-hybridation. Cette étape consiste à déshybrider les sondes auto- complémentaires puis à les ré-hybrider. Ce processus semble important puisque, après l'étape de spotting, nous ne pouvons pas nous assurer de la conguration exacte dans laquelle se trouve les sondes hairpins (simple ou double brin). Pour cela, les lames sont plongées 2 x 20 secondes dans de l'eau milliQ bouillante à l'aide d'un porte lames (protocole adapté de [Strohsahl et al., 2007]). Un cache auto-adhésif est alors placé sur les lames et les chambres d'incubation sont remplies avec du tampon d'hybridation 1 M. Les lames sont placées dans une étuve à 50 °C pendant 1 h. Elles sont ensuite lavées avec les solutions de lavage (0,3 M puis 0,03 M) 5 min à température ambiante, puis séchées par centrifugation (3 minutes à 600 g).

Les lames sont alors lues suivant le protocole décrit au paragraphe précédent. Une fois validée (CV pour chaque sonde < 15 %), un nouveau cache est placé sur chaque lame et les chambres d'incubation sont remplies avec les solutions enzymatiques à étudier. Les lames sont alors mises à incuber 1 h à 37 °C avant d'être à nouveau lavées, séchées, lues et quantiées comme précé- demment.

5.4.6 Détection de l'activité de la MGMT sur lame

Dans le cas des expériences menées sur la MGMT, le protocole est légèrement modié. Pour l'enzyme puriée, après l'étape d'hybridation, un cache adhésif est placé sur la lame et les chambres d'incubation sont remplies avec la solution contenant l'enzyme dans son tampon (volume d'environ 17 µL). La lame est alors placée dans une étuve 2 h à 37 °C. La lame est ensuite lavée avec les solutions de lavage (0,3 M puis 0,03 M) 5 minutes à température ambiante avant d'être séchée par centrifugation (3 minutes à 600 g). Un nouveau cache adhésif est alors placé sur la lame et les chambres d'incubation sont remplies avec une solution contenant ou non l'enzyme PstI dans son tampon enzymatique. Une incubation de 1 h à 37 °C est alors réalisée puis la lame est lavée, séchée, lue et quantiée selon le protocole décrit précédemment.

Dans le cas où cette activité est mesurée dans un extrait cellulaire, nous utilisons un cache d'épaisseur plus importante (Arrayit). Ceci nous permet d'augmenter le volume de réaction, dans ce cas 100 µL, nécessaire pour contenir 200 µg d'extrait (HeLa S3 à 4,5 µg/mL et HeLa MR à 5 µg/mL). Les lames sont ainsi incubées 1h30 à 37 °C en présence des extraits avant d'être lavées, séchées et lues. Un nouveau cache adhésif (volume d'environ 17 µL) est ensuite à nouveau placé sur les lames. Les chambres d'incubation sont remplies avec du tampon d'hybridation 1 M et les lames placées 1 h dans une étuve à 50 °C. Elles sont ensuite lavées et séchées, puis un autre cache est placé et chaque bloc des lames est incubé avec une solution contenant ou non l'enzyme PstI dans son tampon enzymatique, pendant 1 h à 37 °C. Les lames sont nalement lavées, séchées, lues et quantiées comme précédemment.

5.5  Enzymes et tampons enzymatiques utilisés

5.4.7 Détermination de la densité des lames

Nous réalisons tout d'abord une courbe de calibration représentant l'intensité de uorescence mesurée en fonction de la quantité de sonde déposée. Pour cela, nous déposons manuellement 0,5 µL des solutions contenant la sonde HP PstI à diérentes concentrations (1 µM, 2 µM, 5 µM, 8 µM, 10 µM) diluées dans de l'eau milliQ. Nous laissons alors les spots sécher à température ambiante. Une fois secs, ces derniers sont quantiés par uorescence ce qui nous permet de tracer la courbe de calibration avec en abscisse la quantité de sonde déposée et en ordonnée la uorescence correpondante.

Sur une autre lame, nous déposons manuellement 0,5 µL des solutions de sonde aux mêmes concentrations mais dans les conditions d'immobilisation standard, c'est-à-dire en présence de cuivre (5 eq) et de DIPEA (25 eq). La réaction est réalisée pendant une nuit puis la lame est lavée et lue (au même gain que la lame servant à la courbe de calibration, dans notre cas 150). La uorescence lue correspond ainsi aux sondes covalemment greées. En se servant de la courbe de calibration nous pouvons ainsi établir la quantité, en pmoles, de sondes greées.

Nous déterminons alors la densité de sondes en utilisant la formule suivante où Na est le

nombre d'Avogadro (6, 02214 × 1023 _mol−1_{) :}

Densit´e (mol´ecules/cm2) = sondesgref f ´ees(pmoles) × Na× 10

−4

π × (rayon (µm))2 (5.1)

5.5 Enzymes et tampons enzymatiques utilisés

Le tableau (5.4) récapitule l'ensemble des enzymes et extraits cellulaires utilisés au cours des diverses manipulations enzymatiques.

5.6 Préparation d'un extrait nucléaire à partir de cellules

Les extraits sont préparés à partir de cellules congelées à -80 °C. Tout d'abord, les cellules sont décongelées et centifugées 5 min à 500 g. Elles sont reprises dans 1 mL de PBS, an de les rincer, puis centrifugées à nouveau 5 min à 500 g. Le culot de cellules est repris à froid dans du tampon de lyse A (10 mM HEPES pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,02 % Triton X-100,

0,5 mM DTT, 18 µg/mL PMSF ; 500 µL de tampon de lyse A par tranche de 106_{cellules), puis}

sont placées 20 min sur de la glace. Les cellules sont ensuite vortexées 30 s an de faciliter la lyse de la membrane cytoplasmique. La lyse est vériée au bleu de trypan. Pour cela on prélève 1 µL d'extrait que l'on mélange à 9 µL de bleu de trypan et on regarde la coloration des cellules sous microscope. Si celles-ci sont colorées cela signie que la lyse a fonctionné. Une fois la lyse vériée, les noyaux sont culottés par centrifugation de la solution 5 min à 2300 g à 4 °C. Les protéines cytoplasmiques se trouvent alors dans le surnageant qui est éliminé. Les noyaux sont repris dans du tampon de lyse B (10 mM HEPES pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 400 mM KCl, 0,2 mM

EDTA, 25 % glycérol, 0,5 mM DTT, 18 µg/mL PMSF, 0,7 X antiprotéase (Roche Diagnostics) ; 12,5 µl / million de cellules). Les noyaux sont ainsi incubés 20 min sur de la glace. Pour faciliter la lyse des noyaux, deux cycles de congélation (30 s dans l'azote liquide) - décongélation (5 min à 4 °C) sont réalisés. Finalement la solution est centrifugée 10 min à 16000 g ce qui permet de séparer les débris membranaires des protéines nucléaires contenues dans le surnageant. Le lysat

Enzyme/extrait Source (com-_merciale...) Concentration Tampon utilisé (1X) PstI Invitrogen 10 U/µL 50 mM Tris-HCl pH 810 mM MgCl2

50 mM NaCl EcoRI Invitrogen 10 U/µL 50 mM Tris-HCl pH 810 mM MgCl2

100 mM NaCl Fpg New England_Biolabs 8 U/µL

10 mM bis Tris propane-HCl 10 mM MgCl2

1 mM DTT pH=7.0 Ape1 Trevigen 2,5 U/µL

10 mM HEPES-KOH 100 mM KCl 10 mM MgCl2 pH 7.4 UNG Sigma et New England Biolabs 1 U/µL et 5 U/µL 50 mM HEPES 50 mM KCl 0,25 % TritonX-100 10 µg/mL BSA pH 7.5

hAag Trevigen 10 U/µL

10 mM KCl 10 mM (NH4)2SO4 20 mM Tris-HCl 2 mM MgSO4 0,1 % Triton X-100 pH 8.8 MGMT Alexis 100 U/µL 50 mM HEPES 50 mM KCl 0.,25 % Triton X-100 10 µg/mL BSA pH 7.5

extrait nucléaire HeLa Cilbiotech 10 ou 9 µg/mL_{selon le lot} 10 mM HEPES/KOH pH 7,8_{2 mM EGTA/KOH pH 7,8} extrait nucléaire U373 Cellules 2,75 µg/mL 80 mM KCl

extrait nucléaire U373-IV3 fournies 3,01 µg/mL 0,1 mM ZnCl2

extrait nucléaire U373-IV3-TMZ par Dr L. Pelletier 2,8 µg/mL 1 mM DTT 0,5 µg/mL BSA extrait total HeLa S3 Pr B. Kaina 4,5 µg/mL Tampon enzymatique extrait total HeLa MR Pr B. Kaina 5 µg/mL de la MGMT

Tableau 5.4  Tableau récapitulatif des enzymes, extraits cellulaires et tampons enzymatiques utilisés

5.7  Protocoles liés aux analyses par RPE pulsée nucléaire ainsi obtenu est aliquoté et stocké à -80°C jusqu'à utilisation. 2 µL sont prélevés et ajoutés à 318 µL d'eau milliQ pour le dosage.

Le dosage des protéines de l'extrait est réalisé par la méthode de l'acide bicinchonique du kit BCA (Interchim).

5.7 Protocoles liés aux analyses par RPE pulsée

5.7.1 Marquage des sondes par des nitroxydes par chimie click

La réaction de chimie click est réalisée en faisant réagir une quantité d'oligonucléotide alcyne avec 25 eq de DIPEA (solution à 50 mM), 5 eq de CuI (solution à 10 mM) et un excès d'azido- TEMPO (solution diluée dans du DMSO). La solution est placée une nuit à 37 °C sous légère agitation (600 rpm). Typiquement, pour 30 nmoles d'oligonucléotide alcyne nous utilisons environ 1 µmole d'azido-tempo dans un volume de réaction de 140 µL (tableau (5.5)). An de s'assurer que la réaction est complète, une fraction du mélange réactionnel est analysée par HPLC analytique (colonne C18, 300 Å, gradient AcN/TEAA 4-16 % en 42 min, débit 1 mL/min). Le volume est ensuite complété à 500 µL avec de l'eau milliQ et le mélange réactionnel est dessalé sur une colonne d'exclusion NAP-5. Après addition de TEAA (concentration nale de 10 mM) au sein de l'échantillon dessalé, celui-ci est purié par HPLC sur un système analytique (colonne C18, gradient AcN/TEAA 4-16 % en 42 min, débit 1 mL/min). L'oligonucléotide bi-marqué ainsi purié est lyophilisé puis repris dans de l'eau milliQ et contrôlé par HPLC analytique et par spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Pour le brin d'ADN mono-marqué utilisé dans le système en triangle, le protocole utilisé est identique à celui décrit pour les oligonucléotides bi-marqués.

Oligonucléotide alcyne 30 nmoles

DIPEA (50 mM) 15 µL

CuI (10 mM) 15 µL

Azido-tempo (0,5 M) 2 µL

Tableau 5.5  Conditions de réactions classiquement utilisées pour le bi-marquage par chimie click des sondes oligonucléotidiques pour les analyses de RPE

5.7.2 Mesures des températures de fusion

Une solution de duplex contenant 1 µg de chaque brin d'ADN dans 55 µL de tampon d'hy- bridation (400 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl2, pH 7,4), complété à 200 µL avec de

l'eau milliQ. La solution est alors portée à 90°C pendant deux minutes avant d'être redescendue progressivement à température ambiante.

Une cuve de spectromètre est ensuite remplie avec la solution à analyser avant d'être placée dans un spectromètre UV-visible (8453 UV-visible Spectrophotometer Agilent). L'absorbance à 260 nm de la solution est mesurée toutes les minutes en réalisant une rampe de température de

20 °C à 70 °C (incrément de 0,5 °C/min). La température de fusion est déterminée à partir de la courbe obtenue à l'aide du logiciel UV-visible Chemstation.

5.7.3 Préparation des échantillons pour les analyses en RPE pulsée

Dans un premier temps, 3 nmoles de brin bi-marqué et un excès de brin complémentaire (1,5 ou 2,2 équivalents selon les expériences) sont placés dans un eppendorf. La solution est alors évaporée au speed-vac. 18 µL d'un tampon (400 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, 40 mM MgCl2,

pH 7,4) sont ajoutés et complétés avec 42 µL d'eau milliQ. La solution est alors chauée à 90°C pendant 2 min puis redescendue progressivement à température ambiante (hybridation des deux brins). La solution est séchée au speed-vac. 45 µL de D2O et 15 µL de glycérol deutéré sont

ajoutés puis la solution est transférée dans un tube RPE et congelée dans de l'azote liquide. L'échantillon est conservé ainsi jusqu'à l'analyse par RPE pulsée.

5.7.4 Détermination des distances par RPE pulsée

Les mesures par RPE pulsée sont réalisées par G. Sicoli ou V. Maurel du laboratoire de Résonnance Magnétique du CEA-grenoble (DSM/INAC/SCIB/LRM). Ces mesures sont eec- tuées à 60-70 K sur un spectrométre Bruker ELEXSYS E580 (Bruker). La séquence utilisée pour toutes les expériences de RPE pulsée est la séquence DEER (double electron electron resonance) à 4 pulses (gure (5.2)) [Jeschke et Polyhach, 2007]. La fréquence d'observation utilisée est de 75 MHz. Les mesures ont été accumulées sur une nuit.

La détermination de la distribution de distances est réalisée par l'intermédiaire du programme DeerAnalysis2006-07 faisant appel à la régularisation de Tikhonov [Jeschke et al., 2006a].

Figure 5.2  Séquence DEER à 4 pulses utilisée pour la détermination des distances par RPE pulsée

5.7.5 Préparation des oligonucléotides contenant les lésions platinées

L'oligonucléotide non-lésé (typiquement 100 nmoles) est mis à réagir pendant une nuit avec une solution de cisplatine (7,5 eq, Merck) ou d'oxaliplatine (aussi appelé Eloxatine, 7,5 eq,

5.7  Protocoles liés aux analyses par RPE pulsée Sano-Aventis) dans un volume de 200 µL. Les mélanges réactionnels obtenus sont ensuite puriés par chromatographie HPLC analytique (colonne C18, 300 Å, 250x4,6 mm, gradient AcN/TEAA 10 mM 5-12 %, débit 1 mL/min). Les oligonucléotides ainsi obtenus sont analysés par HPLC analytique et par spectrométrie de masse MALDI-TOF.

5.7.6 Digestion par les exonucléases des oligonucléotides contenant les lésions platinées

Digestion par la Phosphodiestérase I (Crotalus venom) 3'→5'

200 pmoles de chaque oligonucléotide sont séchés et repris dans 15,5 µL d'eau milliQ et 4 µL de tampon citrate d'ammonium 500 mM (pH 5). On ajoute 0,5 µL de phosphodiestérase I à 0,03 U/µL (Sigma-aldrich), et la solution est incubée à 37 °C. On réalise,à des temps donnés, des prélèvements de 1 µL auxquels on ajoute 9 µL d'eau milliQ. 1 µL de la solution est alors déposée sur la cible pour analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Digestion par la Phosphodiestérase II (Bovine Spleen) 5'→3'

200 pmoles de chaque oligonucléotide sont séchées et reprises dans 15 µL d'eau milliQ et 4 µL de tampon citrate d'ammonium 500 mM (pH 5). On rajoute alors 1 µL de phosphodiestérase II à 0,01 U/µL (Sigma-aldrich), et la solution est incubée à 37 °C. On réalise, à des temps donnés, des prélèvements de 1 µL auxquels on ajoute 9 µL d'eau milliQ. 1 µL de la solution est alors déposée sur la cible pour analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF.

5.7.7 Préparation des sondes nucléiques duplex tri-marquées

Préparation du duplex tri-marqué

La préparation du duplex est similaire à celle précédemment décrite (paragraphe 5.7.3 page précédente) en remplacant le tampon par celui de l'enzyme EndoIV (Trevigen, concentration nale : 10 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl). Pour cela, 3 nmoles de brin bi-marqué et placé en mélange avec 1,5 eq de brin mono-marqué complémentaire. Le tout est alors séché au speed-vac et repris par 6 µL de tampon 10 X de EndoIV et 54 µL d'eau milliQ. La solution est alors chauée à 90 °C pendant 2 min puis redescendue progressivement à température ambiante (hybridation des deux brins).

Préparation de l'échantillon pour la mesure par RPE pulsée

Une fois le duplex réalisé, la solution est évaporée au speed-vac puis reprise par 45 µL de D2O et 15 µL de glycérol deutéré. L'échantillon est alors transféré dans un tube RPE et analysé.

Préparation de l'échantillon pour la détection de l'activité de coupure de l'EndoIV par RPE pulsée

Une fois le duplex réalisé dans le tampon de l'enzyme (60 µL), nous ajoutons 5 µL de la protéine EndoIV à 1 U/µL (Trevigen) et le mélange réactionnel est incubé 1 h à 37 °C. La solution est alors réduite à environ 2-3 µL au speed-vac (sans chauage), avant d'ajouter 45 µL