comme la technique de FRET nécessite l'introduction de marqueurs, dans ce cas paramagné- tiques, en général des radicaux, au sein de la molécule d'ADN. Néanmoins ces radicaux sont en général de petites tailles, contrairement aux uorophores utilisés dans le FRET, et modi ent ainsi moins la structure de la molécule étudiée.
La RPE pulsée a été utilisée notamment, pour l'étude de protéines [Borbat et al., 2002], ou encore de duplex d'ADN [Schiemann et al., 2007]. De plus, cette technique a récemment été em- ployée dans notre groupe pour étudier diérentes conformations d'ADN. Sicoli et al. ont ainsi montré le potentiel de cette méthode pour mesurer les changements de conformation entre deux des formes de l'ADN : ADN-A et ADN-B [Sicoli et al., 2008]. De plus, utilisant la RPE pulsée, ils ont observé les changements structuraux de la molécule d'ADN induits par certaines bases modi- ées de l'ADN comme la 8-oxoG ou encore divers analogues de sites abasiques [Sicoli et al., 2009].
4.2 Contexte général et objectifs de l'étude
4.2.1 Stratégies de marquage de l'ADN pour les études de RPE pulsée
Nous avons vu que la RPE pulsée permettait de mesurer la distance entre deux spins élec- troniques. Ainsi, la détermination correcte de distances par cette technique dépend directement de la qualité du marquage employé. L'introduction ciblée de marqueurs de spin (centres parama- gnétiques) au sein des molécules est connue sous le nom de site-directed spin labeling (SDSL). Pour l'étude de l'ADN et de l'ARN, les centres paramagnétiques sont très souvent des dérivés radicalaires nitroxydes, chimiquement inertes et stables [Wachowius et Höbartner, 2010]. Les ni- troxydes peuvent être introduits au sein de l'ADN sur le phosphate reliant les nucléotides, sur le sucre ou encore sur les bases. Diverses stratégies de marquage ont été utilisées pour introduire ces radicaux.
Les nitroxydes peuvent, par exemple, être insérés au cours de la synthèse chimique sur support des oligonucléotides à l'aide de phosphoramidites. Schiemann et al. ont utilisé cette stratégie pour marquer de l'ADN sur une thymine avec un radical (nucléotide correspondant présenté sur la gure (4.5)) [Schiemann et al., 2007]. De même, Barhate et al. ont développé un phosphoramidite dérivé, contenant un nitroxyde sur une guanine modi ée (nucléotide correspondant présenté sur la gure (4.5)) [Barhate et al., 2007]. Néanmoins, au cours de la synthèse chimique sur support, les radicaux peuvent se décomposer et cette méthode peut nécessiter des modi cations du cycle normal de synthèse et devenir ainsi délicate et fastidieuse.
Grant et al. ont, eux, utilisé une réaction enzymatique a n de marquer un oligonucléotide à l'extrémité 5'. A l'aide de la T4 kinase ils ont inséré un groupement phosphorothioate en 5' qu'ils ont ensuite fait réagir avec un radical nitroxide contenant une fonction iodure (nucléotide correspondant présenté sur la gure (4.5)) [Grant et Qin, 2007] . Cette technique nécessite néan- moins deux étapes ainsi que l'utilisation d'une enzyme et ne permet le marquage qu'en 5' de la séquence oligonucléotidique.
Une stratégie beaucoup plus répandue est d'insérer, au cours de la synthèse de l'oligonu- cléotide, un nucléotide modi é que l'on fait ensuite réagir avec un marqueur de spin adéquat. Edwards et al. ont, par exemple, marqué un oligonucléotide sur le sucre en utilisant un dérivé 2'-amino-uridine qu'ils ont fait réagir avec un dérivé isocyanate du radical nitroxyde TEMPO
(2,2,6,6-tétraméthylpiperidine-N-oxyle), (nucléotide correspondant présenté sur la gure (4.5)) [Edwards et al., 2001]. Piton et al. ont également utilisé des nucléotides modi és, mais cette fois pour marquer un oligonucléotide d'ARN sur une des bases. Ils ont ainsi inséré les nucléo- tides 5-iodo-uridine, 5-iodo-cytidine et 2-iodo-adénosine dans la séquence. Les fonctions iodures ont alors été substituées par un dérivé alcyne d'un nitroxyde selon la chimie de Sonogashira (exemple du dérivé de l'adénosine présenté sur la gure (4.5)) [Piton et al., 2007]. L'originalité de leur technique repose sur le fait que le marquage de l'oligonucléotide a été réalisé directement après sa synthèse, sur le support et sans puri cation préalable. Néanmoins, pour obtenir des ren- dements quantitatifs, deux substitutions successives sont nécessaires. Au laboratoire, G. Mathis et G. Sicoli ont bi-marqué un oligonucléotide, d'ADN cette fois, sur la position N2 d'une guanine
[Sicoli et al., 2008]. Pour cela ils ont inséré une 2- uoro-hypoxanthine au sein de la molécule, puis le groupement uorure a alors été substitué par un dérivé aminé du radical TEMPO selon la chimie précédemment décrite par Okamoto et al. [Okamoto et al., 2004] (nucléotide fonction- nalisé par le nitroxyde TEMPO présenté sur la gure (4.5)). Néanmoins, cette chimie est di cile à mettre en oeuvre et conduit à des rendements faibles.
Nous avons vu qu'il existe diérentes stratégies permettant d'introduire les radicaux ni- troxydes au sein de la molécule d'ADN. Un paramètre important du marquage utilisé est qu'il doit être su samment rigide pour permettre la détermination correcte de la distance entre les deux nitroxydes (distributions de distances nes). De plus, lorsque l'on souhaite comparer des distances pour deux molécules dont la structure globale varie peu, il est important d'utiliser un marquage su samment rigide pour permettre de les distinguer. Néanmoins, le marquage employé ne doit pas perturber la structure de la molécule à étudier, ce qui peut être le cas lorsque celui-ci est trop rigide.
Ainsi, l'introduction du marquage radicalaire sur un phosphate, comme l'ont décrit Grant et al., mène à un système relativement souple, ce qui peut être un inconvénient lors du calcul de la distribution de distances. De même, le marquage au niveau du sucre peut également s'avérer assez souple. Au contraire, le marquage de la base est souvent associé à une plus grande rigidité, à condition que le linker, reliant le nitroxyde à la base, soit su samment rigide. Il est important, dans ce cas, que le marquage ne gêne pas l'appariement de la base modi ée au sein du duplex d'ADN. Ainsi, l'équipe de S. Sigurdsson a mis au point un dérivé nitroxyde d'une désoxycytidine permettant un marquage rigide sans modi cation de la structure de la molécule d'ADN (voir composé Bahrate et al. sur la gure (4.5)) [Barhate et al., 2007, Cekan et al., 2008]. Le mar- quage sur la base utilisé par Piton et al., leur a permis de déterminer des distances entre deux radicaux insérés dans un double brin d'ADN avec dse distributions très nes (largeurs de distri- bution, à mi-hauteur, entre 0,6 Å et 1,4 Å) [Piton et al., 2007]. Au laboratoire, les distributions de distances obtenues, via l'insertion d'un dérivé nitroxyde de la base guanine, sont su samment nes pour permettre d'étudier des changements structuraux induits par diverses lésions de l'ADN [Sicoli et al., 2009].
4.2 Contexte général et objectifs de l'étude
Figure 4.5 Exemple de nucléotides modi és par des nitroxydes pour l'étude de la structure de l'ADN par RPE pulsée
4.2.2 Objectifs de l'étude
Nous venons de le voir, la chimie de marquage des oligonucléotides est une étape clef pour les études par RPE pulsée. Chacune des méthodes, exposées plus haut, présente des avantages et des inconvénients, en terme de facilité de mise en oeuvre de la chimie et de rigidité du système généré.
Au laboratoire, une étude préliminaire avait été menée pour appliquer la chimie click, précé- demment décrite dans les chapitres 2 et 3 pour la conception des biopuces, au marquage d'oligo- nucléotides par des sondes radicalaires TEMPO [Fontecave, 2007]. Cette chimie particulièrement e cace, semble tout à fait pertinente pour ce type de marquage. En eet, elle se réalise dans des conditions douces, compatibles avec la stabilité des nitroxydes, et doit permettre l'obtention de rendements quantitatifs, et est ainsi adaptée à la réalisation de bi-marquage de l'ADN. Très récemment cette approche a d'ailleurs été utilisée par Jakobsen et al. pour marquer (mono- marquage) un oligonucléotide par un radical nitroxyde et étudier, par RPE continue, l'analogue de site abasique THF [Jakobsen et al., 2010].
Nous avons donc poursuivi l'étude prélimaire, menée au laboratoire sur l'utilisation de la chi- mie click pour l'introduction de radicaux nitroxydes au sein d'oligonucléotides. Dans un premier temps, nous avons comparé deux stratégies de marquage : sur le sucre et sur une des bases de l'ADN. Nous avons ensuite appliqué cette stratégie de marquage pour la préparation de sondes nucléiques paramagnétiques pour l'étude de plusieurs lésions de l'ADN. Nous avons nalement montré le potentiel d'une telle approche pour le multi-marquage et avons construit un double brin d'ADN tri-marqué, ce qui nous a notamment permis de détecter une activité enzymatique de réparation de l'ADN.
Dans cette étude, notre travail a consisté à préparer les échantillons à analyser. Les mesures RPE ont été réalisées par V. Maurel et G. Sicoli de l'équipe de S. Gambarelli du laboratoire de résonance magnétique du CEA-Grenoble (DSM/INAC/SCIB).