Détection des activités de la BER à partir d'enzymes puriées

Nous avons tout d'abord testé la biopuce avec des enzymes puriées reconnaissant les lésions introduites sur la puce. Ainsi, une première expérience a consisté à incuber les lames fonction- nalisées avec une gamme d'AP-endonucléase humaine, Ape1. Nous avons ainsi pu établir un pourcentage de coupure suivant le calcul préalablement expliqué au chapitre précédent (voir équation 2.1 page 75). Comme l'indique la gure (3.14), nous observons une coupure spécique de la sonde HP THF par rapport à la sonde HP Uracile. De plus, le taux de coupure de la sonde HP THF dépend de la quantité d'Ape1. Le résultat est donc en accord avec ce que nous attendions puisque le THF, contrairement à l'uracile, est un substrat connu pour cette enzyme. Nous avons ensuite souhaité mettre en évidence la réparation de l'uracile par UNG sur la biopuce. UNG étant une glycosylase mono-fonctionnelle, excisant la base uracile et générant un site abasique, nous avons utilisé Ape1 comme révélateur de son activité. Pour cela nous nous

-10% 10% 30% 50% HP THF HP Uracile C ou pu re ( % )

0,5U 2U 10U 15U 20U

Figure 3.14  Pourcentages de coupure obtenus sur lame après incubation (1 h, 37 °C) avec une gamme d'Ape1.

Figure 3.15  Validation par analyse PAGE dénaturante de la réparation de la sonde HP Uracile (15 pmoles de sonde hairpin, 20 µL ; UNG : 0.1 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 5 U, 10 U ; Ape1 10 U). sommes placés à une quantité xe d'Ape1 et nous avons fait varier la quantité d'UNG.

Nous avons tout d'abord réalisé cette expérience en utilisant une analyse PAGE an de vérier la fonctionnalité de la sonde HP Uracile et la compatibilité de couple d'enzymes (tampons, temps quantité d'enzymes). Pour cela nous avons incubé la sonde HP Uracile avec les deux enzymes dans le tampon enzymatique d'Ape1. Ce tampon a été choisi car Ape1 a besoin de Mg2+ _pour

être active et que ce cation n'est pas présent dans le tampon commercial de la glycosylase UNG. Nous avons ainsi pu observer une dose dépendance de la coupure de cette sonde en fonction de la quantité d'UNG, avec un maximum atteint pour 1 unité d'UNG (piste 3 du gel présenté dans la gure (3.15)). Nous avons également vérié que la présence seule d'Ape1 n'induit pas une coupure de la sonde (piste 8, gure (3.15)). Cela montre donc que l'enzyme UNG est bien active dans ces conditions de réaction, et valide l'utilisation de Ape1 comme révélateur de l'activité d'UNG.

Nous avons ensuite réalisé la même expérience sur lame. Dans ce cas, nous observons égale- ment une coupure de la sonde HP uracile dépendante de la quantité d'UNG, avec un plateau qui est atteint entre 1 et 2 unités d'UNG (gure (3.16)). La sonde HP THF est, quant à elle, coupée de manière similaire quelle que soit la quantité d'UNG présente. Ceci est conforme à ce que nous attendions puisque cette sonde contient un analogue de site abasique qui n'est pas reconnu par UNG mais directement par Ape1. La quantité d'Ape1 étant xe, il est normal d'observer un taux de coupure identique pour cette sonde quelle que soit la quantité d'UNG utilisée.

Ainsi, nous avons montré que la biopuce développée ici est utilisable pour détecter des acti- vités de réparation de l'ADN par la voie BER à partir d'enzymes puriées.

3.1.3.2 Détection des activités de la BER à partir d'extraits cellulaires

Nous avons ensuite appliqué ce biocapteur à la détection de ces activités de réparation au sein d'un extrait cellulaire. Pour cela nous avons incubé la biopuce avec un extrait nucléaire de cellules HeLa commercial. Nous avons au préalable réalisé une analyse par PAGE de la coupure des sondes par cet extrait. Les résultats obtenus montrent une coupure maximale de la sonde HP Uracile pour une concentration en extrait nucléaire HeLa pour 500 µg/mL (gure (3.17)).

3.1  Biopuce à hairpins pour la détection d'activités de réparation de la BER 0% 20% 40% 60% HP THF HP Uracile C ou pu re ( % )

0,01U 0,05U 0,1U 1U 2U

Figure 3.16  Pourcentages de coupure obtenus sur lame après incubation (1 h, 37 °C) avec une gamme d'UNG en présence d'Ape1 (20 U).

Figure 3.17  Analyse par PAGE dénaturante de la coupure des sondes HP Uracile et HP THF en solution par un extrait nucléaire HeLa (15 pmoles d'hairpin, 20 µL ; extrait HeLa nucléaire : 0, 5, 25, 50, 250, 500, 1000 µg/mL ; +* = 500 µg/mL).

Nous voulions nous assurer de pouvoir détecter une coupure sur la biopuce, c'est pourquoi nous avons choisi deux concentrations hautes en extraits pour l'incubation : 200 µg/mL, et 500 µL/mL. Dans ces conditions, nous avons observé une coupure spécique des deux sondes substrats (gure (3.18)). En eet, aucune dégradation de la sonde témoin, HP PstI, n'a été consta- tée (gure (3.18a)). De plus, nous obtenons des pourcentages de coupure des sondes HP THF et HP Uracile quasi-identiques, pour les deux concentrations choisies indiquant qu'un plateau a été atteint (gure (3.18b)). Dans ces conditions, nous pouvons remarquer que la coupure de la sonde HP THF est légèrement plus faible que celle de la sonde HP Uracile. Néanmoins, des ma- nipulations similaires réalisées par la suite sur un lot neuf d'extrait HeLa n'ont pas conrmé cet eet (voir paragraphe 3.2.1.1 page 115). Il est donc probable que ce phénomène soit uniquement dû à l'extrait utilisé ici qui apparaît moins actif que celui utilisé par la suite.

Nous avons ensuite utilisé le biocapteur pour réaliser un suivi en temps de la coupure de ces deux sondes. Pour cela, nous nous sommes placés à une concentration en extrait nucléaire HeLa de 200 µg/mL pour laquelle nous obtenions une coupure maximale, et nous avons incubé les diérents blocs d'une même lame avec cette solution à diérents temps. La réaction a alors été arrêtée 2 heures après la première incubation. Cette technique est néanmoins délicate à

(a) Images en fausses couleurs après incuba- tion avec 0 µg/mL ou 200 µg/mL d'extrait nucléaire HeLa. 0% 20% 40% 60% HP THF HP Uracile C ou pu re ( % ) 200µg/mL 500µg/mL

(b) Pourcentages de coupure des sondes HP THF et HP Uracile obtenus pour 200 µg/mL et 500 µg/mL d'extrait nucléaire HeLa. Figure 3.18  Détection des activités d'UNG et d'Ape1 sur la biopuce à ADN après incubation (1 h, 37 °C) avec une gamme d'extrait nucléaire HeLa sur lame.

appliquer pour des mesures précises et semble peu adaptée pour mesurer des cinétiques précises. En eet, lors de cette manipulation nous avons utilisé la même solution enzymatique que nous avons déposée à diérents temps. Il serait probablement préférable de ne pas laisser une solution contenant les diérentes enzymes plusieurs heures avant utilisation (bien que nous ayons pris la précaution de la conserver dans la glace). De plus, la mesure précise du temps d'incubation repose sur la rapidité du dépôt de la solution sur la lame qui peut parfois se révéler délicat.

Nous avons néanmoins pu suivre au cours du temps la réparation des deux sondes substrats immobilisées sur la biopuce. Nous avons observé, dans ces conditions, des cinétiques de réaction similaires avec un taux de coupure maximal pour environ 1 h de réaction, pour les deux sondes hairpins substrats (HP THF et HP Uracile) (gure (3.19)).

A priori on pourrait penser que l'incision de la sonde HP Uracile nécessitant deux étapes (excision de la base par UNG puis incision du brin par Ape1), la coupure de cette sonde néces- siterait plus de temps que la coupure de la sonde HP THF qui, elle, ne nécessite qu'une étape. Néanmoins, dans ces conditions, nous sommes probablement en très large excès d'enzymes par rapport aux substrats. De plus, la présence d'Ape1 fonctionnelle stimule l'excision de la base uracile par UNG qui se fait alors très rapidement [Kavli et al., 2002]. Ainsi l'étape limitante semble être celle de la coupure du lien phosphodiester par Ape1 qui est, a priori, identique pour la sonde HP THF et pour la sonde contenant le site abasique (sonde HP Uracile après excision de la base). Dans ces conditions, il ne semble donc pas aberrant d'observer une coupure des deux sondes à des vitesses de réaction similaires.

Nous avons donc validé ce système de biopuce à ADN pour détecter les activités de réparation d'une glycosylase mono-fonctionnelle et d'une AP-endoncléase à partir d'enzymes puriées mais également à partir d'un extrait cellulaire. Nous avons néanmoins constaté que les pourcentages de coupure obtenus ne dépassaient pas 60 % alors que nous avions obtenu précédemment jusqu'à 90 % de coupure dans le cas des sondes en duplex (voir Chapitre 2, paragraphe 2.7.1 page 75) ou encore dans le cas de l'incubation des sondes avec la nucléase P1 (voir Chapitre 3, page 89).

3.1  Biopuce à hairpins pour la détection d'activités de réparation de la BER

-10%

10%

30%

50%

70%

0

20

40

60

80

100

120

HP Uracile

HP THF

Figure 3.19  Cinétique de coupure sur lame des sondes hairpins THF et Uracile par 200 µg/mL d'extrait nucléaire HeLa.

Nous avons donc cherché à comprendre l'origine de cette limitation et avons essayé d'améliorer le système en utilisant plusieurs approches complémentaires.

3.1.4 Limitations et essais d'amélioration du système

Au chapitre précédent, nous avions obtenu des pourcentages de coupure de l'ordre de 90 % lors de l'expérience concernant la réparation de la 8-oxoG par la glycosylase Fpg (voir paragraphe 2.7.1 page 75). Bien que dans le cas de la nouvelle biopuce nous n'ayons pas ciblé cette activité de réparation, nous nous attendions à obtenir des pourcentages de coupure similaires. En eet, quelles que soient les enzymes utilisées (PstI, EcoRI, Ape1, UNG/Ape1), nous obtenons toujours un pourcentage de coupure plafonné à environ 60 %.

Nous avons donc cherché à comprendre la raison de cette limitation et avons essayé d'optimiser notre système en jouant sur diérents paramètres. Ainsi, nous avons tout d'abord étudié les paramètres enzymatiques (température et temps), puis nous avons travaillé sur l'accessibilité des sondes.