Le mécanisme de la BER

Ce mécanisme de réparation se déroule en plusieurs étapes. La première étape est la recon- naissance et l'excision du dommage suivi de l'incision de lien phosphodiester. Le résidu généré est alors enlevé ceci an de permettre l'étape suivante de resynthèse. Le nucléotide adéquat est alors replacé an de reconstituer la séquence d'origine. Le mécanisme s'achève par une étape de ligation du fragment resynthétisé.

L'excision de la base et les ADN N-glycosylases

Au coeur de ce processus, interviennent des enzymes appelées ADN N-glycosylases qui initient la réparation en reconnaissant et en excisant la base endommagée [Scharer, 2003, Cline et Hanawalt, 2003, Slupphaug et al., 2003]. En règle générale, chaque lésion est reconnue spéciquement par une glycosylase. D'une manière générale, chez l'homme ces enzymes sont beaucoup plus spéciques que chez les bactéries. Il existe néamoins, chez l'homme, certaines re- dondances. Ainsi, la base endommagée peut être reconnue par diérentes glycosylases selon son contexte de séquence ou encore selon si l'ADN est sous forme simple ou double brin. Le tableau (1.1) présente les diérentes glycosylases humaines connues à ce jour, ainsi que certains substrats qu'elles reconnaissent. Bien que ces enzymes aient pour fonction l'excision de la base endomma- gée par coupure du lien N-glycosydique reliant la base au sucre, il existe deux catégories de glycosylases. On distingue ainsi les ADN N-glycosylases mono-fonctionnelles et les glycosylases bi-fonctionnelles. Les glycosylases mono-fonctionnelles, comme l'uracile N-glycosylase (UNG), possèdent uniquement la fonction d'hydrolyse du lien N-glycosydique reliant la base endomma- gée au sucre. Pour cela elles utilisent une molécule d'eau pour attaquer le carbone anomérique du nucléotide (gure (1.16)) [Stivers et Jiang, 2003]. Les ADN N-glycosylases bi-fonctionnelles, comme la 8-oxoguanine glycosylase (OGG1), quant à elles, hydrolysent le lien N-glycosydique et incisent également le lien phosphodiester par leur activité AP-lyase (tableau (1.1)). Contraire- ment aux glycosylase mono-fonctionnelles, elles utilisent un de leur résidus aminés pour exciser la base endommagée (gure (1.16)) [Stivers et Jiang, 2003]. Certaines glycosylases, utilisées au cours de notre étude, seront détaillées plus loin (voir paragraphe 1.5.2 page 29).

L'incision du lien phosphodiester

Lorsque la glycosylase est mono-fonctionnelle, elle coupe le lien N-glycosydique entre le sucre à la base lésée formant ainsi un site abasique. Une AP-endonucléase (APurinique ou APyrimidique

1.5  La réparation par excision de base

Glycosylase Substrats majoritaires_{(base excisée en gras)} Activité_AP-lyase

UNG

(UNG1 : mitochondriale, UNG2 : nucléaire)

U(simple brin), U : G, U : A Non SMUG1 U, U : G , U : A, 5-hydroxyméthylU Non

TDG U : G, εC : G, T : G Non

MBD4 U/TpG : 5-meCpG , U/T : G Non

OGG1 8-oxoG : C, FapyG : C Oui

MYH A : G, A : 8-oxoG Non

Aag (MPG, ANPG) 3-MePurine, 7-MePurine, hypoxanthine,_εA Non NTH1 5-OHC, Thymine glycol : A/G, FapyG Oui NEIL1 8-oxoG : C, 8-oxoG : G, Thymine_{glycol : A/C/G, 5-OHU, 5-OHC} Oui

NEIL2 5-OHU, 5-OHC Oui

Tableau 1.1  Les diérentes ADN N-glycosylases humaines, adapté de [Scharer, 2003, Cline et Hanawalt, 2003, Slupphaug et al., 2003].

Figure 1.16  Mécanisme d'excision de la base lésée par les glycosylases mono-fonctionnelles et bi-fonctionnelles, d'après [Stivers et Jiang, 2003].

Endonucléase, Ape1 chez l'homme) hydrolyse alors le lien phosphodiester en 5' du site abasique et génère ainsi une cassure simple brin de la molécule d'ADN. Son action conduit à une extrémité 3' OH et à un résidu 5' désoxyribose phosphate (5' dRP) (tableau (1.2)).

Lorsque la glycosylase est bi-fonctionnelle, c'est elle qui réalise l'incision du lien phosphodies- ter grâce à son activité AP-lyase. Elle génère ainsi une base de Schi qui est ensuite éliminée par b- ou b,d-élimination. L'enzyme OGG1, par exemple, utilise un mécanisme de b-élimination tandis que NEIL1 agit par b,d-élimination. Après une b-élimination le résidu en 3' est un aldé- hyde insaturé tandis qu'après une b,d-élimination l'extrémité 3' est constituée d'un groupement phosphate. Pour ces deux mécanismes de coupure du squelette ribose-phosphate, l'extrémité 5' est un groupement phosphate. Les extrémités obtenues après incision du brin d'ADN par une AP-lyase ainsi que celles obtenues lors d'une cassure simple brin générée par un rayonnement ionisant, comme les rayons X, sont indiquées dans le tableau (1.2) [Xu et al., 2008].

Substrat reconnu Enzymes/événements_{créant la coupure} Extrémités autour_{de la cassure}

Protéine requise pour la

préparation des extrémités Dommage alkylé

(ex : 3-Me-Adénine) Glycosylasemono-fonctionnelle 3' OH, 5' dRP pol b

Site abasique Ape1 3' OH, 5' dRP pol b

Base oxydée

(ex : 8-oxoG) Glycosylasebi-fonctionnelle 3' aldéhyde insaturé,5' PO4 Ape1

Base oxydée

(ex : 5-OH-cytosine) Ape1 3' OH,5' OH résidu cytosine FEN1 Base oxydée

(ex : 5-OH-cytosine) NEIL1/NEIL2 3' PO4, 5' PO4 PNKP

Cassures simple brin Irradiation 5' PO4, 3' PO4 ou

3' phosphoglycolate PNKP ou Ape1 Tableau 1.2  Natures possibles des extrémités après l'étape d'incision lors de la BER ou d'un événement de coupure de chaîne simple brin, et protéines impliquées dans la préparation des extrémités (gap-tailoring), d'après [Almeida et Sobol, 2007].

Ces glycosylases bien qu'étant connues pour être bi-fonctionnelles peuvent également ne réa- liser que l'étape d'excision de la base. En eet, il a été montré que dans certains cas (par exemple pour les glycosylases OGG1 et NTH1), Ape1 pouvait déplacer la glycosylase bi-fonctionnelle et réaliser cette étape d'incision à sa place [Marenstein et al., 2003, Vidal et al., 2001].

La polymérisation de l'ADN nécessite que l'extrémité 3' soit un hydroxyle et que l'extrémité 5' soit un phosphate. Une protéine est ainsi responsable du nettoyage des extrémités. Selon les extrémités obtenues, la protéine impliquée dans leur nettoyage ne sera pas la même (tableau (1.2)).

Après action d'une glycosylase mono-fonctionnelle suivie de celle d'Ape1, les extrémités sont 3' OH et 5' dRP. C'est alors pol b, aidée de la protéine XRCC1 (X-ray cross-complementing 1), qui intervient pour transformer l'extrémité 5' dRP en 5' PO4, via son activité AP-lyase. Dans

1.5  La réparation par excision de base certains cas, cette extrémité n'est pas nettoyée et la suite de la réparation se fait selon la voie dite du long patch repair (voir paragraphe sur l'étape de resynthèse).

Pour les glycosylases bi-fonctionnelles, l'extrémité 5' est déjà un phosphate. Il est néan- moins nécessaire de nettoyer l'extrémité 3'. Lorsque le résidu 3' est un aldéhyde insaturé, comme après action d'une glycosylase bi-fonctionnelle agissant par mécansime de b-élimination, comme OGG1, c'est Ape1 qui nettoie cette extrémité [Almeida et Sobol, 2007]. Lorsque la ré- paration est cette fois initiée par une glycosylase agissant par b,d-élimination, l'extrémité 3' est un groupement phosphate. Dans ce cas, c'est, chez les mammifères, l'enzyme PNKP (po- lynucleotide kinase/phosphatase) qui assure principalement cette fonction, aidée de PARP1 et XRCC1 [Almeida et Sobol, 2007]. L'AP-endonucléase, Ape1, est également connue pour avoir une capacité de coupure du 3' phosphate mais dans une moindre mesure [Wilson et Bohr, 2007]. Resynthèse de la séquence d'origine et ligation nale

Une fois l'incision réalisée, deux voies de resynthèse sont possibles : celle du short patch repair (majoritaire), et celle du long-patch repair [Wilson et Bohr, 2007]. Le choix de l'une ou l'autre des deux voies de la BER n'est pas encore complètement clair et dépend du type cellulaire, de la phase du cycle cellulaire et également du dommage présent. Par exemple, les sites abasiques spontanément formés sont généralement réparés par le long patch repair [Sancar et al., 2004]. Il semble que ce choix dépende également de la concentration en ATP proche du site abasique formé spontanément ou après action de la glycosylase. Ainsi, à faible concentration en ATP le long patch repair se produit plus fréquemment, alors qu'à concentration élevée il semble que le short patch repair soit la voie majoritaire [Robertson et al., 2009].

Le short-patch repair (gure (1.17))

Une fois les extrémités nettoyées, pol b aidée de XRCC1, comble la brèche avec le nucléotide adéquat. La ligase 3a aidée, elle aussi, par XRCC1 assure ensuite la ligation nale. Cette voie est empruntée à la fois lorsque la réparation est initiée par une glycosylase mono-fonctionnelle et par une glycosylase bi-fonctionnelle.

Le long-patch repair (gure (1.17))

Lorsque le résidu 5' est réfractaire à l'activité AP-lyase de pol b, parce qu'il a été modié d'une manière ou d'une autre, la polymérase pol b ajoute un nucléotide en 3' de la cassure. La poly- mérase pol d ou pol e ajoute ensuite plusieurs nucléotides (2 à 7, contrairement au short-patch repair), aidée de PCNA (proliferating cell nuclear antigen) et du facteur de réplication RFC. L'endonucléase FEN1 (Flap endonucléase 1) excise ensuite l'ancien fragment de nucléotides et génère une extrémité 5'-PO4. Pour cette voie de resynthèse la ligase LigI assure la ligation nale

[Sharma et Dianov, 2007]. Les voies alternatives

Les cassures simple brin ne nécessitent pas l'intervention d'une glycosylase. Dans ce cas, la reconnaissance du dommage est assurée par la protéine PARP1 qui recrute de nombreuses

Figure 1.17  Schéma général de la réparation par excision de base (BER).

protéines pour assurer la réparation. Une des premières protéines recrutée est XRCC1 qui in- teragit avec PARP1 pour former une base sur laquelle le complexe de réparation est construit [Almeida et Sobol, 2007]. La suite de la réparation est similaire au short patch repair.

Lorsque la réparation est initiée par les glycosylases NEIL1 ou NEIL2, la suite de répara- tion ne fait pas intervenir l'enzyme Ape1 pourtant présente pour les mécanismes initiés par les autres glycosylase. On sépare parfois cette voie du reste de la BER bien que certaines étapes soient communes [Almeida et Sobol, 2007]. Nous le signalons ici mais cette réparation a déjà été évoquées plus haut, lors de la description des étapes de la BER.

Récemment un nouveau mécanisme de réparation, la réparation par incision de nucléotides (NIR), a été décrite pour certains dommages oxydatifs [Ischenko et Saparbaev, 2002]. La lé- sion 5-hydroxy-2'-désoxycytidine (5-OH-cytosine) semble par exemple pouvoir être réparée par cette voie. La NIR peut être considérée comme une autre voie possible de la BER. L'initia- tion de cette réparation fait intervenir essentiellement Ape1 [Almeida et Sobol, 2007]. Ape1 clive le lien phosphate en 5' du nucléotide lésé et le résidu 5' est alors pris en charge par FEN1 [Dyrkheeva et al., 2007]. La suite de cette réparation est similaire aux autres voies de la BER.

1.5  La réparation par excision de base