Applications à l'étude d'inhibiteurs de la réparation

Nous avons voulu déterminer la pertinence de la biopuce développée, pour l'étude d'inhibi- teurs de la réparation. Nous avons vu que les inhibiteurs de la réparation sont actuellement très étudiés pour l'amélioration des traitements antitumoraux. Dans le cadre de ces études, notre outil semble particulièrement adapté pour le screening de tels inhibiteurs. Nous avons donc étu- dié deux inhibiteurs connus de la voie de la BER, l'Ugi, inhibiteur de la glycosylase UNG, et la méthoxyamine, inhibiteur de l'AP-endonucléase Ape1.

3.1.5.1 L'Ugi, un inhibiteur de l'UNG

Le peptide Uracil DNA-Glycosylase Inhibitor, Ugi, est un inhibiteur connu de la glycosylase UNG [Bennett et Mosbaugh, 1992]. Ce peptide est issu du bactériophage PBS2 et interagit avec la protéine UNG en formant un complexe 1 : 1. Ce complexe stable est formé très rapidement (<30 secondes) et conduit à l'inhibition de l'activité enzymatique de l'UNG [Bennett et al., 1993]. Nous avons donc mis en évidence l'activité inhibitrice de ce peptide, au sein d'un extrait nucléaire HeLa, à l'aide de nos biopuces. An de s'assurer de la bonne formation du complexe avec l'UNG présent dans les extraits, nous avons préincubé diérentes quantités du peptide Ugi

0%

20%

40%

60%

80%

HP uracile T6

HP THF

0U/µL 0,02U/µL 0,08U/µL 0,12U/µL

Figure 3.32  Eet d'inhibition du peptide Ugi sur la coupure par un extrait de cellules HeLa (200 µg/mL), des sondes HP THF et HP Uracile, sur lame.

avec une solution d'extrait nucléaire HeLa à 200 µg/mL. Nous avons ensuite incubé les lames fonctionnelles avec ces diérentes solutions.

Nous avons également réalisé une manipulation similaire avec la sonde HP Uracile en solution en présence d'une concentration de 500 µg/mL d'extrait nucléaire HeLa suivie d'une analyse PAGE.

Sur la biopuce nous obtenons une inhibition spécique de la coupure de la sonde HP Uracile maximale dès une concentration en Ugi de 0,08 U/µL (gure (3.32)). En comparaison, l'expé- rience réalisée en solution, montre une inhibition maximale pour une concentration de 0,1 U/µL (piste 5, gure (3.33)). Sachant que la concentration en extrait utilisée en solution est 2,5 fois plus élevée que pour la biopuce, on s'attendrait à obtenir un maximum d'inhibition autour de 0,04 U/µL sur la biopuce. Nous ne disposons pas de ce point exact sur la lame mais, sachant que pour 0,02 U/µL nous n'obtenons pas d'inhibition de la coupure et que dès 0,08 U/µL nous avons une inhibtion maximum, il est probable que le maximum soit en réalité obtenu pour une concentration intermédiaire. Ceci semble donc cohérent avec l'analyse réalisée en solution.

Comme nous l'attendions, la coupure de la sonde HP THF n'est pas aectée par l'ajout d'Ugi, indiquant bien que cet inhibiteur est spécique des enzymes de réparation impliquées dans l'excision de la base uracile.

Nous remarquons néanmoins que, bien que l'inhibition de la coupure de la sonde HP Uracile soit maximale, il reste une légère coupure lors de l'expérience sur lame et sur gel. Il est connu que bien que l'UNG soit la glycosylase majoritaire pour la réparation de la base uracile appariée à une adénine, une seconde glycosylase, SMUG1, a également la capacité, plus faible, d'exciser l'uracile dans ce contexte [Kavli et al., 2002, Haushalter et al., 1999]. De plus, il a été montré que l'Ugi in- hibe majoritairement UNG et très faiblement SMUG1 [An et al., 2005, Nilsen et al., 2001]. Ainsi, le faible taux de coupure résiduel détecté pourrait être attribué à l'activité de cette glycosylase. Ces expériences conrment que, dans ces conditions, l'UNG est la principale glycosylase impliquée dans l'initiation de la réparation de l'uracile appariée à une adénine.

3.1  Biopuce à hairpins pour la détection d'activités de réparation de la BER

Figure 3.33  Anaylse PAGE de l'inhibition de la réparation de l'uracile par (15 pmoles d'hairpin HP Uracile, 20 µL ; extraits HeLa nucléaire : 500 µg/mL ; Ugi : 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 U/µL). 3.1.5.2 La méthoxyamine, un inhibiteur d'Ape1

Nous l'avons vu précédemment (voir Chapitre 1, paragraphe 1.7.1.2 page 43), l'AP- endonucléase est une cible thérapeutique privilégiée des inhibiteurs de la réparation de l'ADN.

La méthoxyamine est un exemple connu d'inhibiteur de cette enzyme. Son action inhibitrice se fait de manière indirecte par réaction avec le substrat d'Ape1. En eet, cette amine réagit avec la fonction aldéhyde de la forme ouverte du site abasique générant un composé qui n'est plus substrat pour Ape1 [Liu et Gerson, 2004] (gure (3.34)). Cette réaction conduit au blocage de la réparation de l'ADN et mène à la mort cellulaire par un processus évoqué au Chapitre 1 (paragraphe 1.7.1.2 page 43).

Figure 3.34  Mécanisme de réaction de la méthoxyamine sur le site abasique.

Nous avons ainsi voulu mettre en évidence cette activité d'inhibition indirecte et spécique de l'activité de coupure du site abasique par Ape1, à partir de notre biocapteur. Pour cela, nous nous sommes placés à une concentration en extraits nucléaires HeLa de 200 µg/mL. Il a été décrit précédemment dans la littérature, que la présence de méthoxyamine ne perturbe pas l'activité de la glycosylase UNG [Liuzzi et Talpaert-Borlé, 1985]. Nous avons donc incubé le biocapteur avec une solution contenant à la fois l'extrait cellulaire et la méthoxyamine. Une expérience témoin

0%

20%

40%

60%

80%

HP uracile T6

HP THF

0mM

50mM

100mM

200mM

300mM

Figure 3.35  Eet de la méthoxyamine sur la coupure des sondes HP THF et HP Uracile par un extrait nucléaire de cellules HeLa (200 µg/mL) sur lame.

a également été réalisée en solution sur les sondes HP Uracile et HP THF suivie d'une analyse PAGE.

Nous avons pu constater une diminution dose-dépendante avec la concentration en méthoxy- amine, de la coupure de la sonde HP Uracile, sur lame et sur gel (gures (3.35) et (3.36)). L'ajout de cette molécule n'a pas d'eet sur la coupure de la sonde HP THF, ce qui indique qu'elle n'a pas d'eet direct sur l'enzyme Ape1. Puisqu'il est connu que cette molécule n'interagit pas avec UNG, cela conrme le mécanisme d'action de cette molécule. En eet, le THF est un substrat pour Ape1 mais celui-ci ne possède pas la fonction alcool en position anomérique, permettant l'ouverture du cycle du désoxyribose. Ainsi, pour le THF, la fonction aldéhyde n'est pas présente et ne peut donc pas réagir avec la méthoxyamine.

Sur la biopuce, contrairement aux observations précédentes avec l'Ugi, nous obtenons une inhibition complète, entre 200 mM et 300 mM de méthoxyamine. Nous pouvons noter que cette concentration nécessaire en inhibiteur est très élevée. Il est probable que la méthoxyamine réagisse également avec d'autres composants de l'extrait cellulaire, notamment les protéines. Ainsi, seule une fraction de la méthoxyamine réagit avec le site abasique cible, présent sur la lame. Les protocoles d'études, rapportés dans la littérature, portant sur l'impact de la méthoxyamine sur l'activité d'Ape1, sont souvent décomposés en plusieurs étapes. En eet, dans un premier temps un oligonucléotide contenant une uracile est incubé avec la glycosylase UNG, puis est incubé avec une solution de méthoxyamine (de l'ordre de 50 mM). L'oligonucléotide est alors précipité avant d'être nalement incubé avec Ape1 [Horton et al., 2000, Yan et al., 2007]. Dans ce cas, la méthoxyamine ne peut pas réagir avec d'autres composants ce qui explique les plus faibles concentrations en méthoxyamine utilisées. Dans une autre étude cependant, Rosa et al. ont utilisé un oligonucléotide contenant une uracile (270 fmoles) et l'ont incubé avec un extrait cellulaire HeLa en présence de méthoxyamine [Rosa et al., 1991]. Dans ce cas l'inhibition complète de la coupure est observée pour une concentration en méthoxyamine de 200 mM, ce qui est en accord avec les résultats que nous obtenons ici avec nos biocapteurs.

3.1  Biopuce à hairpins pour la détection d'activités de réparation de la BER

Figure 3.36  Inhibition, par la méthoxyamine, de la coupure de la sonde HP Uracile (15 pmoles de sonde, 20 µL ; extrait nucléaire de cellules HeLa : 500 µg/mL ; Méthoxyamine : 50, 100, 200 mM ; +* = 200 mM).

3.1.5.3 Conclusions

Nous avons mis en évidence ici, la performance et la pertinence de la biopuce développée ici pour tester des inhibiteurs de la réparation. Ainsi, la présence de plusieurs sondes portant des susbtrats diérents sur une même biopuce permet de paralléliser les expériences et d'obtenir des informations supplémentaires. Ainsi, ce type de biocapteur nous permet de conrmer les mécanismes d'action, directs ou indirects, des inhibiteurs connus testés. Du fait de la spécicité mutliple des enzymes étudiées, notamment de l'Ape1 qui intervient dans la réparation des sites abasiques quelle que soit l'enzyme qui excise la base endommagée, il peut être dicile de conclure sur la cible exacte de molécule inhibitrice (enzymes/substrats). Ainsi, dans le cas précis que nous avons présenté ici, il ne serait pas possible directement de conclure sur le mécanisme de ces inhibiteurs s'ils n'étaient pas déjà connus. Prenons le cas de la méthoxyamine, nous constatons une inhibition de la coupure de l'uracile mais pas du THF, ce qui permet de conclure que son action ne se porte pas sur l'enzyme Ape1. Néanmoins, on pourrait penser que cette molécule agit sur l'enzyme UNG. Ainsi, si nous voulions nous assurer que son action porte sur le substrat site abasique et non sur l'enzyme UNG, il surait d'incorporer sur la puce une autre sonde reconnue par une autre glycosylase mono-fonctionnelle. Ainsi, si l'eet de cet inhibiteur est visible pour les deux sondes, nous pourrions en conclure que son action est bien liée à la réaction avec le site abasique et non avec la glycosylase UNG. Nous pouvons également procéder par étape en incubant tout d'abord le biocapteur avec la glycosylase UNG puriée, puis avec l'inhibiteur et enn avec l'AP-endonucléase puriée. Il en est de même pour tous les inhibiteurs.

Finalement, le fait que les sondes oligonucléotidiques soient xées sur un support rend les manipulations beaucoup plus simples notamment si l'on souhaite procéder par étape (suppression des étapes intermédiaires de précipitation de l'ADN lors des test classique d'analyse PAGE). Le fait de pouvoir conner dans un espace restreint plusieurs sondes substrats pour diérentes enzymes de réparation permet de cibler de nombreuses activités enzymatiques et de pouvoir tester l'action de nouvelles molécules candidates pour l'inhibition de la réparation de l'ADN.

3.2 Biopuce à sondes hairpins pour détecter la réparation des