Détermination des distances par RPE pulsée

Une fois les oligonucléotides comportant les adduits platinés puriés et caractérisés, ceux-ci ont été hybridés avec le brin complémentaire bi-marqué, sur la base et sur le sucre, suivant le pro- tocole précédemment établi. La détermination des distances inter-spin (entre les deux nitroxydes)

(a) Brin non-lésé ([M-H]− _{attendue : 4791,2 g/mol,} [M-H]−_{mesurée : 4789,5 g/mol).}

(b) Brin cisplatine ([M-H]− _{attendue :}

5022,2 g/mol, [M-H]−_{mesurée : 5021,4 g/mol).} (c) Brin oxaliplatine ([M-H]

− _atten- due : 5100,5 g/mol, [M-H]−_{mesurée :} 5098,7 g/mol).

Figure 4.15  Spectre de masse MALDI-TOF (mode négatif) des brins non-lésé (a), cisplatine (b) et oxaliplatine (c).

4.4  Détection de déformations induites par des lésions de l'ADN

(a) Après 30 min de réaction avec l'exonucléase

3'→5'. (b) Après 2 h de réaction avec l'exonucléase 3'→5'

(c) Après 30 min de réaction avec l'exonucléase

5'→3'. (d) Après 2 h de réaction avec l'exonucléase 5'→3'. Figure 4.16  Spectres de masse MALDI-TOF obtenus au cours des réactions de digestion du brin cisplatine par les exonucléases (3'→5' : (a) et (b), 5'→3' : (c) et (d)), pT signie désoxy- thymidine.

(a) Après 2 h de réaction avec l'exonucléase 3'→5'. (b) Après 2 h de réaction avec l'exonucléase 5'→3'. Figure 4.17  Spectres de masse MALDI-TOF obtenus au cours des réactions de digestion du brin oxaliplatine par les exonucléases (3'→5' : (a), 5'→3' : (b)).

a alors été réalisée par RPE pulsée.

La gure (4.18) indique les distributions obtenues avec le marquage sur le sucre pour les duplex Non-lésé, Cisplatine et Oxaliplatine. Les distributions de distances pour les deux duplex lésés sont très larges si bien qu'il est dicile d'interpréter ces résultats. Il apparaît cependant que la présence des adduits platinés ait tendance à diminuer la distance entre les deux nitroxydes par rapport au duplex non-lésé.

La gure (4.19a) représente les distributions de distances obtenues pour les double brins non lésé, cisplatine et oxaliplatine, pour le marquage sur la base. Les valeurs caractéristiques de ces distributions sont données dans le tableau (4.19b). Nous constatons que les distances principales déterminées pour les deux duplex lésés sont plus élevées que celle obtenue pour le duplex non-lésé (4,90 nm pour le double brin cisplatine, 5 nm pour le double brin oxaliplatine, et 4,40 nm pour le non-lésé), les largeurs des distributions restant identiques pour les trois duplex (0,6 nm).

Contrairement au marquage sur le sucre, les résultats obtenus pour le marquage sur la base montrent des distributions relativement nes. Les distances entre les deux sondes nitroxydes mesurées pour les duplex lésés sont signicativement diérentes par rapport au non-lésé (gure (4.19b)). Nous observons ainsi une augmentation de cette distance de 0,5 nm pour le cisplatine et de 0,55 nm pour l'oxaliplatine. Ceci conrme que la présence de l'adduit intra-1,2-GpG platiné modie la structure de la molécule d'ADN. Cette tendance semble a priori être en contradiction avec celle obtenue pour le marquage sur le sucre, pour lequel une diminution de distances est observée. Néanmoins, pour ces duplex, les nitroxydes sont placés à des positions diérentes sur le nucléotide si bien qu'il est important de tenir compte de la structure 3D de la molécule an d'interpréter ces variations de distances. Des essais de modélisations de ce système ont été réalisés par l'équipe de Y. Boulard mais n'ont pas permis d'apporter une réponse claire sur ces résultats. Cette étude théorique est relativement compliquée car elle nécessite la modélisation de nombreuses liaisons moléculaires de natures diverses. Les données des constantes de raideur des liaisons impliquées dans les quatre bases de l'ADN sont maintenant assez bien connues, néanmoins, celles des liaisons du nitroxyde, et encore plus celles des adduits platinés, sont moins connues. Aussi la modélisation de ces duplex est très compliquée et nécessiterait des études complémentaires an d'aner les constantes utilisées.

Les résultats obtenus par RPE pulsée, pour le marquage sur la base, ne permettent pas de distinguer les deux duplex Cisplatine et Oxaliplatine, ce qui va dans le sens d'une déforma- tion globale identique. Des résultats de modélisations de dynamiques moléculaires réalisées par Ramachandran et al. sur un duplex de 12 nucléotides de long, possédant l'adduit intra-1,2-GpG avec le cisplatine et l'oxaliplatine dans un contexte de séquence identique au nôtre (TGGA), montrent une importante diérence de structure globale entre le duplex non-lésé et les duplex lésés [Ramachandran et al., 2009]. Ils n'avaient néanmoins pas déterminé de diérence impor- tante sur la structure globale du duplex entre celui lésé au cisplatine et celui lésé à l'oxaliplatine (gure (4.20)). Les résultats de RPE pulsée que nous avons obtenus dans ce même contexte de séquence semblent donc aller dans le sens de ces travaux.

Cette étude nous a permis de constater que le marquage sur le sucre n'était pas adapté à l'analyse des dommages induisant une diminution de la rigidité du duplex. En eet, celui-ci a

4.4  Détection de déformations induites par des lésions de l'ADN

Figure 4.18  Distribution de distances obtenues par analyse RPE pulsée des duplex non-lésé, Cisplatine et Oxaliplatine pour le marquage en position 2' du sucre, après régularisation de Tikhonov.

(a) Distributions de distances.

Duplex d-(2-15) (nm) W (nm) Dd (nm)

non lésé 4,40 0,6

Cisplatine 4,90 0,6 + 0,50

Oxaliplatine 5,00 0,6 + 0,55

(b) Distances mesurées et largeurs des distributions (à 0,05 nm près).

Figure 4.19  Distribution de distances obtenues par analyse RPE pulsée des duplex non-lésé, Cisplatine et Oxaliplatine pour le marquage en position 5 de la base, après régularisation de Tikhonov.

Figure 4.20  Comparaison des structures, obtenues par modélisation, des duplex contenant les adduits intra-1,2-GpG-cisplatine (en mauve) et intra-1,2-GpG-oxaliplatine (en violet) dans le contexte TGGA [Ramachandran et al., 2009].

conduit à des distributions de distances très larges pour les duplex contenant les lésions plati- nées ne permettant pas une interprétation claire. Le marquage sur la base nous a néanmoins permis d'obtenir, pour les trois lésions étudiées (THF, intra-1,2-GpG-cisplatine et intra-1,2- GpG-oxaliplatine), des distributions susamment nes pour permettre la mise en évidence de changements de distances signicatifs entre ces duplex lésés et le duplex non-lésé. Nous avons ainsi conservé cette stratégie de marquage par chimie click en position 5 de la base uracile pour la suite du projet.