Étude des activités de réparation de lignées cancéreuses de

Nous avons vu que de nombreuses études avaient été menées sur la résistance de cer- taines tumeurs aux traitements anticancéreux alkylants. Aucun traitement curatif n'est à ce jour disponible pour les gliomes malins. Un des traitements utilisés est l'agent méthy- lant témozolomide (TMZ) seul ou en combinaison avec une radiothérapie [Stupp et al., 2009, Spiegl-Kreinecker et al., 2010, Liu et Gerson, 2006]. Il est néanmoins connu que le traitement avec des agents alkylants, tels que le TMZ, conduit à une résistance des cellules cancéreuses limitant ainsi leur ecacité [Liu et Gerson, 2006, Alvino et al., 2006].

Dans le cadre d'une collaboration avec de Dr L. Pelletier, de l'Institut des Neurosciences de Grenoble (unité Inserm U835, équipe 7), nous nous sommes intéressés aux capacités de réparation d'un modèle cellulaire de glioblastomes résistants au témozolomide développé à partir de la lignée U373. Ainsi la lignée U373-IV3 est issue de la lignée U373 après implantation sous-cutanée de cellules U373 chez la souris. Une seconde lignée, U373-IV3-TMZ, a été établie après implantation sous-cutanée de cellules U373 chez la souris et traitement au témozolomide, ce qui les a rendues

3.2  Biopuce à sondes hairpins pour détecter la réparation des bases alkylées

Figure 3.41  Lésions de l'ADN générées par le témozolomide et voies de la réparation impliquées, adapté de [Liu et Gerson, 2006].

résistantes à cet agent.

Le témozolomide méthyle les positions N7 _{(∼70 % des adduits formés), O}6 _{(∼6 % des ad-}

duits formés) et de la guanine et la position N3 _{de l'adénine (∼9 %) [Liu et Gerson, 2006].}

Ces lésions sont néanmoins réparées par deux mécanismes distincts comme nous l'avons déjà rapporté (gure (3.41)). Ainsi, la lésion O6_{-méthylguanine (O6MeG) est réparée par la voie}

de la réparation par réversion via l'enzyme MGMT. Les lésions N7_{-méthylguanine et N}3_-

méthyladénine, sont, quant à elles, réparées par la voie de réparation par excision de base (BER). L'ecacité antitumorale du TMZ est principalement attribuée à la formation de la lésion O6MeG, qui génère une toxicité faisant intervenir la voie de réparation du MMR. Les études analysant la résistance des tumeurs à ce traitement alkylant ont principalement porté sur l'enzyme MGMT et les protéines du MMR. Il a notamment été montré que la méthyla- tion du promoteur de la MGMT était liée à une meilleure ecacité du traitement des tumeurs [Stupp et al., 2009, Liu et Gerson, 2006, Stupp et al., 2007] (voir paragraphe 1.7.2.1 page 45). Les adduits réparés par la BER étant néanmoins majoritaires, il semble intéressant d'étudier le rôle de cette voie de réparation dans ce mécanisme de résistance, d'autant que certaines études sur d'autres modèles cellulaires, ont montré qu'une décience en Aag conduisait à une résistance aux agents alkylants MMS et MNU [Meira et al., 2009, Roth et Samson, 2002].

Il nous a donc semblé intéressant d'étudier la réparation par la voie de Aag/Ape1 pour les trois lignées cellulaires développées notamment celle résistante au témozolomide (U373-IV3-TMZ).

Pour cela, nous avons tout d'abord préparé des extraits nucléaires pour ces trois lignées et avons dosé la concentration totale en protéines pour chaque extrait. Nous avons ensuite incubé

-10% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60%

HP THF HP Uracile HP EcoR1 HP Inosine

C ou pu re ( % )

Lame U373 Lame U373-IV3 Lame U373-IV3-TMZ

Figure 3.42  Comparaison de la coupure par un extrait nucléaire HeLa 50µg/mL sur les trois lames U373, U373-IV3 et U373-IV3-TMZ.

le biocapteur, sur lequel avaient été préalablement immobilisées les sondes évoquées plus haut, avec une gamme de chaque extrait de manière similaire à l'expérience réalisée pour l'extrait HeLa nucléaire. Ainsi, chaque lame correspond à une lignée cellulaire étudiée. Nous avons également incubé, pour chaque lame, deux blocs avec une solution d'extrait nucléaire HeLa (50 µg/mL). Ceci nous permettra de disposer de blocs de référence an de vérier la reproductibilité des lames et de s'assurer qu'il nous est permis de les comparer entre elles.

Comme l'indique la gure (3.42), les taux de coupure des diérentes sondes par l'extrait nucléaire HeLa sont similaires pour les trois lames. Nous pouvons donc les comparer entre elles dans la suite de notre présente étude.

Nous avons ainsi représenté sur un même graphique les pourcentages de coupure obtenus pour les trois lignées en fonction de la concentration protéique avec laquelle le biocapteur a été incubé (gure (3.43)). La coupure de la sonde HP THF représente l'activité de l'enzyme Ape1, celle de la sonde HP Uracile, l'activité du couple UNG/Ape1 et celle la sonde HP Inosine, l'activité du couple Aag/Ape1.

Nous observons ainsi, une coupure similaire par Ape1 tout comme UNG/Ape1 pour les trois lignées (gures (3.43a) et (3.43b)). Ces résultats ont été conrmés par une analyse complémen- taire sur gel d'électrophorèse pour ces trois lignées, pour lesquelles nous observons une dose- dépendance similaire (gure (3.44)).

Concernant l'activité de Aag/Ape1, nous constatons une diérence d'activité pour ces trois lignées. En eet, il apparaît que la lignée U373-IV3-TMZ présente une activité beaucoup plus faible. N'ayant pas observé de diérence d'activité pour Ape1, nous pouvons attribuée cette baisse d'activité à la glycosylase Aag.

Nous n'avons pas pu conrmer ce résultat par analyse PAGE, la coupure spécique à l'action d'Aag étant trop faible et la dégradation de la sonde en solution trop importante. Nous avons

3.2  Biopuce à sondes hairpins pour détecter la réparation des bases alkylées 0% 20% 40% 60% 0 10 20 30 40 50 Concentration en extraits (µg/mL) C o u p u re ( % )

U373 U373-IV3 U373-IV3-TMZ

(a) Comparaison de l'activité d'Ape1.

0% 20% 40% 60% 0 10 20 30 40 50 Concentration en extraits (µg/mL) C o u p u re ( % )

U373 U373-IV3 U373-IV3-TMZ

(b) Comparaison de l'activité d'UNG.

-10% 0% 10% 20% 0 10 20 30 40 50 Concentration en extraits (µg/mL) C o u p u re ( % )

U373 U373-IV3 U373-IV3-TMZ

(c) Comparaison de l'activité d'Aag.

Figure 3.43  Comparaison des activités de Ape1 (sonde HP THF), UNG (sonde HP Uracile) et Aag (sonde HP Inosine) au sein des extraits nucléaires de cellules U373, U373-IV3, U373-IV3- TMZ.

Figure 3.44  Comparaison des activités Ape1 et UNG/Ape1 pour les trois lignées U373, U373- IV3 et U373-IV3-TMZ après analyse sur gel d'électrophorèse (1 pmoles, 1 h 37 °C, 10 µL ; extraits : 0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 50 µg/mL).

3.2  Biopuce à sondes hairpins pour détecter la réparation des bases alkylées

(a) Principe du système de détection des ac- tivités de réparation sur billes fonctionnalisées

(b) Gel d'électrophorèse obtenu après incubation, avec les extraits nucléaires U373, U373-IV3 et U373-IV3-TMZ, de 1 pmole d'oligonu- cléotide Inosine immobilisé sur billes (1 h, 37 °C, extraits : 0, 50, 100, 250, 500, 1000 µg/mL)

Figure 3.45  Principe et résultats obtenus en utilisant le système de billes magnétiques fonc- tionnalisées

néanmoins procédé à une étude complémentaire à l'aide d'un autre test développé au laboratoire, non pas sur lame mais sur bille. Ce système repose sur un principe similaire à celui développé ici, avec des sondes oligonucléotidiques en hairpin immobilisées sur des billes magnétiques. Ainsi, ces billes fonctionnalisées avec des oligonucléotides portant la lésion Inosine ont été incubées avec ces mêmes extraits. La réaction enzymatique du couple Aag/Ape1 entraîne une coupure du lien phosphodiester, ce qui conduit à la déshybridation du duplex, le fragment contenant le uorophore passant alors en solution (gure (3.45a), pour plus de détails sur le principe du test, voir le rapport de stage de Guillaume Gines en annexe B page 217). Les billes magnétiques sont alors culottées par un aimant et le surnageant est analysé sur gel d'électrophorèse (gure (3.45b)). Nous avons ainsi obtenu la même tendance que celle observée sur les lames, avec la présence d'une bande de coupure beaucoup plus faible pour la lignée U373-IV3-TMZ résultant d'une activité moindre de la glycosylase Aag.

L'ensemble de ces résultats est intéressant puisqu'il semble que ces trois lignées présentes des activités de la glycosylase Aag diérentes. Notamment, il semble que l'activité de Aag soit très faible pour la lignée U373-IV3-TMZ, résistante au témozolomide. Néanmoins, d'autres ex- périences complémentaires sont à mener avant de conclure sur le lien direct entre la plus faible activité de la glycosylase Aag décrite ici et la résistance de ces cellules au TMZ.

Ainsi cette première application à un modèle cellulaire complexe, nous a permis de montrer la pertinence du biocapteur développé ici, pour la mesure des activités de réparation de l'ADN. En eet, en utilisant seulement trois lames fonctionnalisées, nous sommes capables de détecter les activités de trois enzymes, et ce pour trois lignées, en réalisant pour chacune une gamme de concentration. De plus, nous avons vu que l'activité de la glycosylase Aag est très faible au sein des extraits cellulaires et qu'elle est, dans ce cas, dicile à mesurer en solution du fait de la dégradation des sondes. La biopuce nous a permis de détecter cette activité aisément, pour des concentrations plus faibles que celles utilisées en solution, et sans qu'une dégradation ne gêne l'analyse.