2.2.1 Caractérisation de la sonde oligonucléotidique
Une première sonde, nommée M (tableau (2.4a)), a été synthétisée via la chimie sur support des phosphoramidites. La fonction alcyne a été incorporée en 5' de la séquence à l'aide d'un nucléoside modi é, la 2'-O-propargyl uridine ( gure (2.4b)). Pour cela, nous avons utilisé un phosphoramidite commercial fourni par la société GeneCust.
Sonde/cible Séquence (5'→3')
Sonde M X-TT TTT TCG GAT ACC CAA GGA Cible cy3 GTC TCC TTG GGT ATC CGA TGT
(a) Séquences de la sonde M et de la cible uorescente.
(b) Structure du nucléoside, noté X : 2'-O-propargyl uridine.
Figure 2.4 Séquences de la sonde M et de la cible uorescente utilisées initialement pour la mise au point des biopuces et structure du nucléoside X modi é contenant la fonction alcyne introduit à l'extrémité 5' de la sonde M.
Une fois synthétisé, l'oligonucléotide a été déprotégé et libéré de son support par un traitement ammoniacal. Cette sonde a ensuite été puri ée par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (r-HPLC, détection en absorbance UV à 260 nm). Sa pureté a été contrôlée par r- HPLC analytique et par spectrométrie de masse MALDI-TOF ( gure (2.5)). Dans ces conditions, un seul pic n est détecté en HPLC (à 20,7 minutes) ce qui montre la pureté et l'intégrité du produit puri é ( gure (2.5a)). Le spectre de masse MALDI-TOF montre la présence de deux pics à 6449,4 g/mol et 3224,7 g/mol ( gure (2.5b)). Le premier correspond au produit attendu ([M- H]−
th´eorique=6450,2 g/mol). Le second pic correspondant à l'ion pseudo-moléculaire bi-chargé du
produit ([M-2H]2−/2
th´eorique=3324,1 g/mol). Ces analyses nous con rment donc que le produit
2.2 Caractérisation de la biopuce
(a) Pro l d'élution r-HPLC de la sonde M (gradient 3- 15 % acétonitrile dans 10 mM TEAA, 42 min, débit 1 mL/min, détection à 260 nm).
(b) Spectre de masse par MALDI-TOF en mode négatif (Masse attendue [M-H]− 6450,2 g/mol ; Masse observée [M-H]−: 6449,4 g/mol).
Figure 2.5 Analyse de la sonde M par chromatographie liquide haute performance (a) et par spectrométrie de masse MALDI-TOF (b).
2.2.2 Caractérisation des lames
Une fois la sonde validée, elle a été immobilisée sur des lames fonctionnalisées par un azo- ture. La fabrication des lames fonctionnalisées ainsi que leur caractérisation ont été réalisées par G. Costa du laboratoire du LETI/DTBS/CEA grenoble (dirigée par F. Vinet) suivant des protocoles préalablement établis par leur équipe.
La première étape consiste à silaniser les lames de verre par un silane contenant une fonction chlore. Le chlore est ensuite substitué, lors d'une seconde étape, par un azoture en utilisant l'azoture de sodium (NaN3) ( gure (2.6)).
Figure 2.6 Schéma de préparation des lames fonctionnalisées par un azoture (n=6 ou n=11). Les lames ont d'abord été caractérisées par une mesure d'angle de contact. Cette mesure permet d'apprécier l'hydrophobicité du support. Pour cela, une goutte d'eau est déposée sur la surface à étudier et l'angle formé entre la tangente à la goutte au point de contact et la surface solide, appelé angle de contact (θC), est mesuré ( gure (2.7)). Les surfaces hydrophobes
Figure 2.7 Schéma de l'angle de contact.
correspondent à des angles de contact élevés et inversement pour les surfaces hydrophiles. A titre d'exemple, les surfaces fortement hydrophiles présentent des angles de contact lors du dépôt de goutte d'eau entre 0° et 30°.
Nous avons mesuré un angle de contact de 78,4° pour les lames après silanisation avec le silane contenant la fonction chlore (Cl-(CH2)6) et un angle de 81,5° pour les lames après substitution du
chlore par l'azoture. Ces deux mesures indiquent que la surface des lames est assez hydrophobe. Le silane que nous avons utilisé possède une chaîne composée de six carbones, qui est donc assez hydrophobe. Des mesures similaires, recensées dans la littérature, indiquaient des angles de contact entre 84-85° pour des surfaces silanisées par un silane Br-(CH2)11 et entre 77-84° après
substitution par l'azoture. Les mesures obtenues sont donc proches de celles mesurées dans la littérature [Prakash et al., 2007].
Le potentiel zéta des lames, qui représente la charge à leur surface, a été évalué. Ainsi, dans les conditions de mesure, la charge à la surface des lames est négative (potentiel zéta mesuré = - 45,23 +/- 1,720 mV, dans tampon KCl 1 mM, pH 6,5). Ce paramètre est favorable pour des manipulations avec l'ADN, chargé négativement, ce qui limite les interactions non-spéci ques des sondes avec la surface [Zammatteo et al., 2000].
Des mesures de spectre moyen infrarouge (MIR) ont ensuite été réalisées a n de véri er la bonne incorporation de la fonction azoture. Comme l'indique la gure (2.8), les lames chloro et azoture possèdent des bandes communes : une large à 3600 cm−1, deux nes à 2930 cm−1 et
2860 cm−1. On note également la présence d'une bande large vers 3200 cm−1 uniquement pour
la lame chloro ainsi qu'une bande ne à 2095 cm−1 uniquement pour la lame azoture.
En utilisant les tables théoriques d'absorption infrarouge, nous avons déterminé la corres- pondance de chaque bande observée sur ce spectre. Ainsi, la bande large à 3600 cm−1, commune
aux deux lames, est relative aux groupements OH des silanols2 des lames. Les bandes nes à
2930 cm−1 et 2860 cm−1 correspondent aux fonctions CH
2 des silanes. La bande large vers
3200 cm−1 correspond à une molécule de H
2O. Le fait que celle-ci ne soit visible que pour la
lame chloro provient du traitement des lames. En eet, la dernière étape de la préparation des lames chloro est un rinçage à l'eau, alors que le dernier rinçage eectué pour les lames azoture est un rinçage au dichlorométhane, ce qui a pour eet d'éliminer les traces d'eau. En n, la bande ne, observée à 2095 cm−1 uniquement pour la lame azoture, est caractérique de cette fonction.
Ceci con rme donc la bonne fonctionnalisation des lames azoture.
2Les silanols sont les composés chimiques formés d'un atome de silicium dont l'un des groupements auxquels il est relié est un hydroxyle.
2.3 Choix du catalyseur et de la concentration en sonde à greer