L'AP-endonucléase humaine

Les apurique/apyrimidique-endonucléases (AP-endonucléases) de classe II sont regroupées en deux familles de protéines selon leur homologie avec les enzymes d'E. coli exonucléase III (ExoIII) et endonucléase IV (EndoIV). Ape1 est l'AP-endonucléase majoritaire chez l'homme (95 % de l'activité AP-endonucléase totale) et l'homologue humain de ExoIII [Sharma et Dianov, 2007, Wilson et Barsky, 2001, Abbotts et Madhusudan, 2010].

Ape1, aussi connue sous le nom de Ref1, hApe, ApeX ou encore hAp1, est à la fois une endonucléase en charge de la réparation des sites abasiques et un facteur redox impliqué dans la régulation des gènes.

Il s'agit d'une protéine nucléaire d'environ 35 kDa, dont le gène est composé de quatre introns et cinq exons. Cette protéine se retrouve également dans le cytoplasme, ce qui est attribué à la réparation de l'ADN mitochondrial et à ses autres fonctions (fonction redox) [Evans et al., 2000, Abbotts et Madhusudan, 2010]. L'expression de la protéine Ape1 dépend de la phase du cycle cellulaire et est maximale en début ou milieu de phase S [Abbotts et Madhusudan, 2010]. Dans les cellules humaines, cette protéine est produite en grande quantité (350000-7000000 molécules par cellule) [Marenstein et al., 2004]. Il a été suggéré que l'expression de Ape1 pouvait s'auto- réguler par xation de cette protéine sur le promoteur de son propre gène, inhibant ainsi sa transcription [Evans et al., 2000]. Il est à noter que l'expression de son gène est inductible et qu'elle est augmentée lors d'un stress oxydatif. Il n'est néanmoins pas encore établi si cette propriété est due à son rôle dans la réparation de l'ADN ou bien à son activité de régulateur transcriptionnel.

Il apparaît que Ape1 est une protéine essentielle pour la croissance et la survie cellulaire, notamment du fait de sa fonction liée à la réparation de l'ADN. Il a été montré que des souris hétérozygotes mutées pour le gène Ape1 mourraient au cours du développement embryonnaire [Xanthoudakis et al., 1996]. La sous-régulation de cette enzyme conduit à l'accumulation de sites

1.5  La réparation par excision de base abasiques toxiques qui peuvent induire l'apoptose. Fung et al. ont supprimé l'expression de la pro- téine Ape1 dans plusieurs types de cellules humaines, par la technique des siRNA, et ont constaté un arrêt de la prolifération cellulaire et l'activation de l'apoptose. L'expression dans ces cellules de la protéine de levure Apn1, capable de réparer de manière similaire à Ape1 les sites abasiques, a supprimé ces eets. Apn1 étant dépourvue d'activité redox, ils en ont déduit que l'activité AP-endonucléase d'Ape1 était essentielle pour la survie cellulaire [Fung et Demple, 2005].

Il a également été montré qu'une décience en Ape1 augmentait la sensibilité à certains stress alkylants et oxydants [Wilson et Barsky, 2001]. A l'inverse la surexpression d'Ape1 dans des cellules possédant initialement un niveau normal en cette protéine, ne conduit pas de manière systématique à une protection envers ces mêmes stress [Evans et al., 2000].

Cette AP-endonucléase, ou plus précisément son domaine C-terminal, hydrolyse le lien phos- phodiester directement en 5' d'un site abasique générant une cassure simple brin 3'-OH et 5'-dRP (gure (1.20)). Cette activité a été montrée comme étant dépendante de la concentration en cation métallique divalent (Mg2+_{, Zn}2+_{) [Wilson et al., 1997, Wilson et Barsky, 2001]. Ce cation métal-}

lique semble intervenir non pas dans l'étape de la formation du complexe enzyme-ADN, mais dans l'étape de coupure [Wilson et Barsky, 2001]. Bien que décrite comme agissant sur des sites aba- siques dans l'ADN double brin, il a été récemment prouvé qu'elle avait également une activité AP- endonucléase sur de l'ADN simple brin [Marenstein et al., 2004]. Son activité sur l'ADN simple brin est néanmoins 20 fois inférieure à celle sur de l'ADN double brin [Dyrkheeva et al., 2007]. Ape1 a besoin, pour son action AP-endonucléase, d'au moins 5 nucléotides en 5' de la lésion et de 3 nucléotides en 3' de la lésion [Wilson et al., 1995]. Certaines mutations dans la séquence d'acides aminés de cette enzyme (Leu104Arg13_{, Glu126Asp, Arg237Ala/Cys et Aspn283Gly)}

induisent une diminution de 40 % à 90 % de son activité [Wilson et Barsky, 2001].

Figure 1.20  Mécanisme d'incision d'un site abasique par l'AP-endonucléase humaine. Cette protéine interagit avec d'autres enzymes de la BER. Il a été proposé qu'elle aide à la dissociation de certaines glycosylases du site abasique formant un complexe plus stable avec celui-ci [Marenstein et al., 2004]. Nous avons vu qu'elle avait un eet stimulant sur les glycosy- lases UNG et SMUG1 en présence de Mg2+_{. La glycosylase TDG interagit physiquement avec}

Ape1 ce qui augmente la capacité de TDG à exciser son substrat [Almeida et Sobol, 2007]. Ape1 aide également à la dissociation de la glycosylase bi-fonctionnelle NTH1 sur le site AP qu'elle génère. Il se pourrait que dans des conditions physiologiques, c'est à dire en forte concentra- tion d'Ape1, NTH1 agisse comme une glycosylase mono-fonctionnelle [Almeida et Sobol, 2007, 13_{Leu104Arg correspond à la mutation de l'acide aminé leucine, en position 104 dans la séquence protéique, en} arginine.

Marenstein et al., 2003]. De manière similaire, elle peut déplacer OGG1 du site AP que celle- ci produit, augmentant ainsi le turnover de cette glycosylase [Hill et al., 2001]. De plus, elle semble intervenir dans les étapes suivantes de la BER. En eet, Ape1 facilite la liaison de pol b sur le site AP non coupé et stimule son activité lyase [Marenstein et al., 2004].

Nous avons vu que cette enzyme est impliquée dans la BER mais elle est également un élé- ment essentiel de la réparation par incision de nucléotides qui est une voie alternative pour cer- taines lésions oxydées [Ischenko et Saparbaev, 2002] (voir paragraphe 1.5.1 page 27). Les condi- tions optimales pour cette activité sont néanmoins très diérentes de celles pour son activité d'AP-endonucléase. En eet, celle-ci se produit à des pH plus acides (pH 6,4-6,8 contre pH 7,8- 8,2) et diminue pour des concentrations salines élevées (KCl>50 mM) [Dyrkheeva et al., 2007]. Sa participation au NIR semble faire intervenir des régions de sa séquence protéique dié- rentes de celles impliquées dans son activité AP-endonucléase et utiliser d'autres mécanismes [Dyrkheeva et al., 2007].

Cette enzyme possède d'autres activités comme une activité de 3'-phosphodiestérase pour le nettoyage des extrémités 3' autres qu'un hydroxyle. Elle intervient ainsi dans la réparation des cassures simple brin de l'ADN générées par des agents tels que la bléomycine ou encore après réparation d'une base lésée par une glycosylase bi-fonctionnelle [Wilson et Bohr, 2007, Abbotts et Madhusudan, 2010, Caldecott, 2008]. D'autres activités plus faibles lui sont connues telles qu'une activité 3'-phosphatase ou 3'-5' exonucléase. Il a été montré que l'activité exo- nucléase de cette enzyme dépend de la concentration en sel monovalent, avec une meilleure ecacité à faible concentration (<25 mM) tandis que sa fonction endonucléase est, elle, maximale à des concentrations salines plus élevées [Dyrkheeva et al., 2007]. Cette enzyme est également capable d'enlever un nucléotide mésapparié en 3' d'un double brin d'ADN [Chou et Cheng, 2003, Chou et Cheng, 2002].

Parallèlement à ses activités en lien avec la réparation de l'ADN, Ape1 possède une fonction de régulateur redox (domaine proche de l'extrémité N-terminale de la protéine). Cette protéine active de nombreux facteurs de transcription et facilite leur liaison à l'ADN via la réduction d'un résidu cystéine [Evans et al., 2000]. Elle semble notamment être impliquée dans l'induction de l'apoptose via p53 [Evans et al., 2000].

Récemment, une autre AP-endonucléase humaine homologue de ExoIII, Ape2, diérant de la séquence protéique d'Ape1 aux extrémités N-terminale et C-terminale, a été découverte dont la fonction est encore peu connue [Wilson et Barsky, 2001, Abbotts et Madhusudan, 2010]. Ape2 possède une faible activité AP-endonucléase mais une plus importante activité 3'-5'-exonucléase [Sharma et Dianov, 2007, Dyrkheeva et al., 2007].