Chapitre 1 Introduction générale
2.1 Production de peaux bilamellaires humaines reconstruites in vitro par auto-
in vitro par auto-assemblage
Les étapes menant à la production de peaux bilamellaires humaines reconstruites in
vitro par auto-assemblage sont illustrées à la Figure 2.1. Les cellules utilisées pour la
production de peaux reconstruites, de feuillets migratoires dermiques et de pansements biologiques ont été prélevées des tissus de donneurs sains ayant consenti de manière libre à une procédure chirurgicale esthétique. Les donneurs ont consenti à ce que leurs tissus résiduels soient utilisés dans le cadre du projet de recherche approuvé par le comité d’éthique du Centre Hospitalier Affilié (CHA).
2.1.1 Production du derme des peaux reconstruites
Un traitement à la thermolysine est effectué sur les biopsies de peau prélevées. Cette technique permet de séparer l’épiderme du derme et de subséquemment mettre en suspension les cellules de chaque compartiment (Larouche et al., 2009, Auger et al., 1995, Germain et al., 1993). Des fibroblastes sont ainsi isolés du compartiment dermique tandis que des kératinocytes sont extraits du compartiment épidermique. Les cellules sont congelées dans l’azote liquide au passage 0 et sont disponibles pour une utilisation prochaine. Le Tableau 2.1 décrit les différentes populations cellulaires utilisées pour la production de dermes reconstruits.
Tableau 2.1 : Populations cellulaires de fibroblastes utilisés pour la production de dermes reconstruits et de feuillets migratoires.
Population
cellulaire Âge Sexe
Passage
utilisé Contexte d’utilisation
Fibro♀21 21 ans Femme P4 Étude pilote
F150698♀25 25 ans Femme P4-P5 Première, deuxième et troisième étude
Des fibroblastes sont décongelés et ensemencés dans des flacons Nunc© de 75 cm2 à une densité de 8 x 103 cellules/cm2 pour procéder à leur amplification. Des comptes au
bleu de trypan permettent de déterminer le nombre de cellules et la viabilité de celles-ci avant l’ensemencement. Les cellules sont cultivées durant sept jours dans un milieu d’expansion 1:1 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DME) : Ham’s F12 (H) medium (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (SVF, Hyclone, Logan, UT, USA) et d’antibiotiques (100 UL/ml pénicilline et 25 µg/mL gentamicine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA). Ce milieu est utilisé uniformément pour la culture des fibroblastes et des CSTA servant aux pansements ainsi que pour la culture des fibroblastes des peaux reconstruites et des feuillets migratoires. Les cellules à confluence sont alors trypsinées et des comptes au bleu de trypan et au Coulter (Coulter Counter, Beckman Coulter, FL, USA) sont effectués pour déterminer à nouveau le nombre, la viabilité et la grosseur des cellules. Les cellules sont incubées à 37°C dans 8% de CO2 et les milieux de culture sont changés tous les deux ou trois jours.Ces étapes d’amplification sont répétées jusqu’au passage 3 ou 4 pour obtenir suffisamment de cellules.
Les fibroblastes sont ensuite trypsinés et ensemencés (1,56 x 104 cellules/cm2)dans des plaques six puits Nunc (VWR international, Mississauga, Ont, Canada, puits de 9,6 cm2) contenant un ancrage de papier filtre (Whatman, Fisher Scientific, Ottawa, Ont, Canada) (Labbé et al., 2011a). Des lingots en acier inoxydable sont ajoutés quelques heures suivant l’ensemencement pour maintenir l’ancrage au fond du puits. Les ancrages rendent les feuillets plus faciles à manipuler (superficie interne de l’ancrage de 3,5 cm2/feuillet) et préviennent la contraction des cellules (Lopez Valle et al., 1992). Les cellules sont cultivées dans le même milieu de culture que lors de l’amplification pour une durée de 28 jours, à l’exception qu’il est additionné de 50 µg/mL (250 µM) d’acide ascorbique (Sigma) préparé du jour dans le but de stimuler la production et l’organisation de la matrice extracellulaire (L'Heureux et al., 1998, Michel et al., 1999). Les milieux de culture sont changés tous les deux ou trois jours dans des conditions d’incubation similaire à l’étape d’amplification.
Figure 2.1 : Étapes de production de peaux bilamellaires reconstruites in vitro.
Après 28 jours en culture, les fibroblastes ont formé des feuillets cellulaires manipulables qui peuvent être empilés. Pour recréer le compartiment dermique de la peau reconstruite, deux feuillets sont empilés et brochés ensemble par l’ancrage en conservant l’orientation originale. Cet empilement de feuillets a pour but de produire un tissu plus épais. Un anneau d’ensemencement, deux éponges faites de Merocel© et trois petits poids en acier sont ajoutés sur chaque empilement pour assurer une meilleure cohésion des feuillets entre eux. Après 24 heures, les Merocel© et l’anneau sont retirés et les petits poids sont placés sur l’ancrage pour maintenir l’empilement immergé dans le milieu de culture. L’empilement demeure en culture pour trois jours dans un pétri contenant du milieu d’expansion additionné d’acide ascorbique avant d’être utilisé comme support à l’ensemencement des kératinocytes.
2.1.2 Production de l’épiderme des peaux reconstruites
Parallèlement, des kératinocytes sont décongelés et ensemencés dans des flacons Nunc© de 75 cm2 à une densité de 6,6 x 103 cellules/cm2 pour procéder à leur amplification. Ils sont ensemencés conjointement à des 3T3 irradiés de souris à une densité de 2 x 104 cellules/cm2 qui servent de couche nourricière aux kératinocytes en culture (Green et al., 1979). Les cellules sont cultivées dans un milieu pour kératinocytes décrit au
Tableau 2.2. Les conditions d’incubation sont les mêmes que pour les fibroblastes et les milieux de culture sont changés tous les deux ou trois jours.Habituellement après cinq jours de culture, les kératinocytes ont atteint une confluence de 80% et sont trypsinés. Un anneau d’ensemencement est alors placé sur chaque empilement de fibroblastes (derme reconstruit) pour permettre l’ajout de 8 x 105 kératinocytes par peau, soit 2,3 x 105 cellules/cm2. Cette étape est effectuée au troisième jour suivant l’empilement des feuillets dermiques. Pour permettre la prolifération des kératinocytes, la peau est laissée en culture immergée pendant sept jours dans un milieu pour kératinocytes additionné d’acide ascorbique (50 µg/ml). Tableau 2.2 : Composition du milieu de culture pour kératinocytes. [Traduit de (Larouche et al., 2009)]
Composante Concentration
3:1 DME : Ham’s F12 medium (Invitrogen) 95% (v/v)
Sérum Fetal clone II (Hyclone) 5% (v/v)
Insuline (Sigma) 5 g/mL
Hydrocortisone (Calbiochem, San Diego, CA) 0.4 g/mL
Toxine du cholera (Sigma) 10-10 M
EGF (Austral Biologicals, San Ramon, CA, USA) 10 ng/mL
Pénicilline G et gentamicine (Sigma) Pénicilline G 100 IU/mL Gentamicine 25 mg/mL Abréviations : DME, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; EGF, Epithelial growth factor.
Les peaux sont ensuite placées à l’interface air-liquide durant 14 jours pour permettre une différenciation appropriée des kératinocytes de l’épiderme. Les peaux sont déposées sur de petites tables en plastique conçues pour permettre au derme d’être en contact avec le milieu de culture et à l’épiderme d’être en contact avec l’air. Une plaque de plastique dotée d’un trou au centre et deux poids sont placés par-dessus l’ancrage pour maintenir la peau en place (Dube et al., 2010). L’EGF normalement contenu dans le milieu de culture pour kératinocytes est retiré pour favoriser la différenciation plutôt que la prolifération cellulaire. Les peaux sont incubées à 37°C dans 8% de CO2 et les milieux de
culture sont changés tous les deux ou trois jours. Au septième des 14 jours de culture à l’interface air-liquide, les peaux sont soulevées et replacées sur les tables pour prévenir l’adhésion. Le temps total de production d’une peau reconstruite depuis l’étape d’ensemencement en plaque des fibroblastes est de 52 jours en utilisant la technique présentée.