A.1. Phase de faisabilité

Cette première phase doit permettre d’évaluer l’effet sporicide des plasmas réalisables sur la plate-forme. Elle comprend la mise en place d’une procédure opérationnelle et décrit les conditions expérimentales apportant une réduction sensible du nombre de spores sur une surface contaminée.

V.A.1.a. Choix de l’agent à stériliser

Un agent à stériliser est choisi pour ces essais et servira ensuite d’indicateur biologique de référence. En concertation avec des spécialistes de microbiologie, et compte tenu des recommandations de la Pharmacopée française (NF T72-230 et NF T72-231), notre choix s’est porté sur une suspension de spores de Bacillus subtilis var. niger (ATCC 9372 – CIP 77.18), conditionnée en flacons, sous une concentration de 10⁹ spores/mL. Cette suspension de spores est fournie par l’Institut Pasteur. Ces souches ont également été choisies pour leur aptitude à produire des spores exemptes de débris de cellules végétatives. Cela évite, dans la mesure du possible, la présence dans les suspensions de spores bactériennes de substances étrangères pouvant interférer dans la réaction entre l’agent stérilisant et les spores.

En fait, la souche de Bacillus subtilis variété niger constitue un étalon international pour les agents sporicides. C’est d’ailleurs une des rares souches de Bacillus subtilis dont les colonies ne sont pas envahissantes [AFNOR NF T72-230 et NF T 72-231].

V.A.1.b. Choix du support de contamination

• Le support doit tout d’abord être suffisamment petit pour être compatible avec les manipulations habituelles au laboratoire.

• De plus, il doit être contaminé de façon homogène, pour assurer une bonne reproductibilité lors des essais. Une surface plane est donc préférée.

• La récupération des spores revivifiables après traitement doit être facilitée ; en effet, une quantification étant nécessaire dans cette phase exploratoire, il ne suffit pas de réaliser un simple test binaire stérile / non stérile ; il faut être en mesure de récupérer la totalité des spores revivifiables afin de réaliser un dénombrement fiable.

• Il est préférable que le matériau soit isolant ; en effet le plasma ne peut être qu’une solution alternative aux procédés conventionnels et utilisé pour la stérilisation de dispositifs thermolabiles. Il est donc souhaitable de se rapprocher autant que possible des applications futures. De plus une structure conductrice pourrait favoriser l’assistance ionique lors d’une polarisation du substrat et perturber en cela les conclusions avancées. Les résultats obtenus ne seraient peut-être pas

• La caractéristique majeure qu’ont les micro-organismes après s’être implantés sur une surface est une augmentation de leur résistance aux agents stérilisants. Cette propriété apparaît dans les heures qui suivent l’adhésion des micro-organismes.

L’augmentation de la résistance a été observée sur des biofilms formés sur du verre [FRANCK J.F., KOFFI R.A.]. Les auteurs ont pu constater que l’efficacité des désinfectants différait fortement selon le matériau support. L’acier inoxydable apparaît nettement plus facile à désinfecter que du verre ou de la céramique [LERICHE V.].

Compte tenu de ces considérations, notre choix du support de contamination s’est initialement orienté vers :

- une lamelle de verre contaminée par une suspension de spores de Bacillus subtilis var niger. La population bactérienne initiale peut être ajustée selon les besoins.

- une bandelette présentant 1.3 10⁶ spores de Bacillus subtilis var niger.

(dimensions : 32*5*1 mm). Ce support, vendu tel quel, a l’avantage de présenter une contamination parfaitement homogène. Compte tenu de l’épaisseur de la bandelette, on peut d’ores et déjà parler d’un traitement en volume. La première difficulté réside dans la faculté du plasma et de certaines espèces actives, à diffuser sur une épaisseur de 1 mm. En outre la récupération de la totalité des spores revivifiables après traitement peut s’avérer difficile.

V.A.1.c. Choix du conditionnement

Le conditionnement est une étape capitale dans le processus de stérilisation. La stérilisation du matériel nu n’est autorisée qu’en cas d’utilisation immédiate du matériel. Les moyens de conditionnement doivent de plus être conçus pour résister aux contraintes habituelles de stérilisation, de transport, et de stockage.

Le conditionnement, lors d’un traitement de stérilisation par plasma, pose un véritable problème. Plusieurs possibilités s’offrent à nos yeux :

- l’échantillon est directement soumis aux espèces actives du plasma et n’est pas conditionné au préalable. L’efficacité du plasma reste optimale. Le

conditionnement doit donc se faire après le traitement, lors de la remise à la pression atmosphérique et cela requiert un environnement stérile.

- l’échantillon est conditionné dans un sachet poreux Tyvek ®. Ce type de sachet assure la pénétration de gaz au travers de la membrane mais empêche la diffusion des agents contaminants à l’extérieur de l’emballage. L’efficacité du plasma au travers de cet emballage reste cependant à démontrer.

- l’échantillon est conditionné dans un sachet hermétiquement scellé et la seule possibilité est alors de générer un plasma induit à l’intérieur du sachet. Cette notion de plasma induit sera détaillée plus largement dans le paragraphe V.G.2.

Durant cette première phase exploratoire, les essais seront réalisés sans conditionnement à seule fin d’étudier l’efficacité brute du plasma sur une surface contaminée.

V.A.1.d. Paramètres de la décharge

Cette étape du programme consiste à définir les paramètres plasma susceptibles d’engendrer l’inactivation de spores bactériennes. Par exemple, le type de décharge employée va conditionner la nature des espèces réactives. Il peut s’agir d’une post-décharge, d’une décharge micro-ondes de type ECR… De même, il est réaliste de penser que la puissance de ces décharges, la pression de travail, la nature des gaz plasmagènes et leur proportion, le temps d’exposition, sont autant de facteurs déterminants dans l’action bactéricide et sporicide.

V.A.2. Phase de compréhension des mécanismes d’inactivation

Cette phase s’appuiera sur les résultats expérimentaux de la phase exploratoire qui seront principalement corrélés à des analyses du plasma par spectroscopie d’émission optique.

Cette étude devra permettre d’affirmer ou d’infirmer certaines hypothèses avancées au terme des premiers essais et de mieux appréhender les mécanismes de destruction liés à la stérilisation par plasma.

V.A.3. Phase d’optimisation

Cette phase prendra en considération les conclusions avancées au terme de l’analyse plasma par spectroscopie d’émission, et devra conduire à optimiser la concentration des espèces supposées jouer un rôle dans l’inactivation des micro-organismes. Elle sera, dans la démarche expérimentale, la poursuite de la phase exploratoire. Si les mécanismes proposés s’avèrent vérifiés, cette optimisation devrait permettre d’atteindre les degrés d’inactivation préconisés pour les procédés de stérilisation.

V.A.4. Champ d’action du procédé

Si au terme de cette optimisation, le plasma présente un réel effet d’inactivation sur la forme sporulée de la bactérie Bacillus subtilis, il conviendra d’élargir le champ d’action du procédé, d’une part en augmentant la charge bactérienne initiale afin de déterminer les limites du procédé, et d’autre part en diversifiant la nature des indicateurs biologiques utilisés. Rien ne permet d’affirmer en effet que Bacillus subtilis sera l’indicateur biologique le plus résistant à l’agent stérilisant qu’est le plasma. Des essais complémentaires devront être réalisés sur un panel représentatif de toutes les espèces de micro-organismes existantes (bactérie à Gram⁺, à gram^-, aérobies ou anaérobies, champignons, mycobactéries, parasites, virus…)

De plus, des études pourront être menées afin de caractériser l’activité sporicide de l’agent stérilisant en fonction de certaines variables, comme la concentration d’espèces actives dans le mélange, le temps d’exposition…, qui pourraient affecter l’activité microbicide.

En parallèle, une diversification des supports de contamination devra être réalisée afin, là encore, de dégager les limites du procédé. Il sera alors possible de travailler sur des natures de supports différents, mais également élargir le champ d’application à des géométries de supports plus complexes. Une validation du procédé pourra alors être mise en œuvre sur des dispositifs médicaux réels.