Neurogenèse

9.1. Injections des marqueurs de la division cellulaire

Les expériences décrites dans ce paragraphe ont été réalisées avec l’appui technique d’Aurélie Genoux (CDD, ingénieure d’étude techniques biologiques IMNC) en collaboration avec Sophie Scotto-Lomassese (Maître de Conférences à l’université Paris 6, Institut du Fer à Moulin, INSERM UMRS-U839, Paris). Pour pouvoir étudier la neurogenèse chez des animaux adultes, les souris ont reçu 3 injections intra-péritonéales de Bromodéoxyuridine (BrdU, 50mg/kg, Sigma-Aldricht), un marqueur exogène de la division cellulaire, à deux heures d’intervalle chacune. Après 21 jours, les animaux ont étés fixés par perfusion intracardiaque (4% de paraformaldéhyde dans 0.1M de PBS (Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, GIBCO).

9.2. Analyse des tissus

Les cerveaux ont été post fixés à 4°C pendant la nuit dans la même solution de paraformaldéhyde et ensuite cryoprotégés pendant 2 jours dans une solution de 30% de sucrose/PBS. Des coupes coronales de 50 µm d’épaisseur ont été préparées grâce à un cryomicrotome (Microm Microtech). Six séries de coupes allant du BO jusqu’à la SVZ (Zone Sous-Ventriculaire) et séparées de 250 µm ont été collectées dans du PBS. Pendant la procédure, les coupes des deux hémibulbes ont été séparées dans différents puits et seul l’un des deux hémibulbes a été utilisé pour l’immunohostochimie. Une série du BO contenait de 5 à 6 coupes coronales, la plus rostrale contenant des cellules mitrales visibles et la couche plexiforme externe, et la plus caudale précédant immédiatement le BO accessoire. Une série de la SVZ est constituée de 5 coupes avec les deux hémisphères, commençant avec une ouverture franche du ventricule latéral et s’achevant immédiatement avant la fusion du ventricule latéral avec la partie dorsale du troisième ventricule. Les tissus ont été conservés à -20°C dans une solution cryoprotectrice (30% d’éthylène glycol et 30% de glycérol dans 0.12 M de tampon phosphate (PBS)), à moins d’une utilisation immédiate.

Les coupes flottantes ont été rincées dans 3 bains successifs de PBS avant l’immunohistochimie. Pour réduire la détection non spécifique, tous les bains et les incubations d’anticorps ont été réalisés dans une solution bloquante contenant 2 g/L de gélatine (Merck) et 0.25% de triton X100 dans du PBS. Pour le marquage au BrdU, les coupes de BO ont étés exposées à de l’HCl 2N pour une hydrolyse d’acides deoxyribonucléique à 37°C pendant 30 min. Les coupes ont ensuite été incubées avec des anticorps anti-BrdU (rat, 1 :400, AbDserotec OBT0030) et des anticorps anti-NEUN (souris, 1:500; Santa Cruz) pendant 48 heures et à 4°C. Les anticorps secondaires d’âne Cy3-conjugué anti-rat (1:800; Jackson ImmunoResearch) et les anticorps d’âne Alexa 488 conjugué

anti-souris (1:500; Molecular Probes) ont étés appliqués aux coupes pendant 2h à température ambiante. Pour la détection du marqueur de cycle cellulaire endogène Ki67, les coupes de la SVZ ont étés incubées avec un anticorps anti-Ki67 (lapin, 1:1000; Novacastra, NCL-Ki67p) durant 48 h à 4°C et révélées par des anticorps secondaires d’âne Cy3-conjugué anti-lapin (1:800; Jackson ImmunoResearch) pendant 2 heures à température ambiante. Toutes les coupes ont été montées sur une lamelle de verre dans du Mowiol (10%, Calbiochem) et du Dabco (2.5%, Sigma).

9.3. Protocole d’analyse et de comptage des cellules

Les images ont été obtenues sur un système confocal Leica SP5, équipé de lasers avec Argon et Diode DPSS 561. Les images ont été acquises à une résolution de 1024 x 1024 pixels.

Le logiciel Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF) a permis de reconstruire automatiquement des mosaïques d’images montrant la totalité des coupes du BO et de la SVZ à partir de tranches optiques prises à la même profondeur Z ; ce niveau Z a été choisi à partir du milieu de chaque coupe pour assurer l’homogénéité et la force de la fluorescence dans toutes les zones de la mosaïque. Pour le marquage NeuN-BrdU du BO, les fluorochromes Alexa 488 et Cy3 ont été séquentiellement excités à des longueurs d’onde de 488 et 561nm, et les photons d’émission ont été collectés par 2 détecteurs ayant une plage/spectre de détection de 500-550nm et 600-680 nm, respectivement. Il convient de préciser que l’autofluorescence issue des granules de lipofuscine, présentes dans les corps cellulaire de la couche periglomerulaire du BO, est détectée dans tout le spectre de longueur d’onde et peut être observée même sur des animaux âgés de 2 mois (Whitman and Greer, 2007). Pour distinguer sans équivoque le signal émis par les granules du marquage au BrdU lorsque l’on excite le tissu avec une longueur d’onde de 488nm, un troisième détecteur collectant spécifiquement les émissions d’autofluorescence comprises entre 700 et 800 nm a été mis en place.

Pendant l’analyse, tous les noyaux ayant montré des motifs (« patterns ») de fluorescence similaires dans les 3 détecteurs ont étés assimilés à des granules de lipofuscine et ont été de ce fait éliminées lors du comptage.

La quantification a été faite manuellement à l’aide des plugins « Cell Counter » du logiciel Fiji. Les cellules BrdU+ dans la couche GCL et PGL ont été quantifiées à partir d’une coupe optique de chaque image mosaïque d’une série du BO. Les progéniteurs présents dans la SVZ étant regroupés de façon très dense, le nombre de cellules Ki67+ a été estimé à partir de deux coupes optiques de chaque série de la SVZ. Dans tous les cas, les résultats sont exprimés en tant que moyenne (+/- SEM) du nombre de cellule par mm2. Pour déterminer le phénotype neuronal des cellules néoformées dans le BO, la colocalisation des marqueurs NeuN et BrdU a été évaluée à la fois dans les couches GCL et PGL (de 180 à 330 et 40 à 100 cellules analysées par animal, respectivement).

Les coupes ont étés analysées en aveugle jusqu’à la fin de l’analyse des données. Les différences entre les groupes expérimentaux ont été analysées par Sophie Scotto avec le test Mann- Whitney sur le logiciel GraphPad Prism. Dans tous les cas, p<0.05 était considéré comme statistiquement significatif.

10. Quantification des marqueurs moléculaires pour estimer l’inflammation