Microcontact printing multicouleur

La méthode du microcontact printing basée sur un encrage du tampon en solution est simple, rapide et peu coûteuse, mais ne permet de transférer qu'un seul type de molécule à la fois. La portée de cette technique serait largement étendue si une même surface pouvait être décorée avec plusieurs types de pro-téines simultanément. L'impression de diérents types de propro-téines sur un même substrat peut être réalisée en utilisant diérentes stratégies. Une possibilité est le transfert séquentiel de plusieurs protéines sur un même substrat en utili-sant plusieurs tampons encrés avec des protéines diérentes. Cette technique est simple à mettre en ÷uvre, mais nécessite une machine d'alignement pour contrôler la position des diérents transferts. La seconde méthode consiste à en-crer le tampon par capillarité en utilisant plusieurs encres simultanément [11].

3.3. Microcontact printing multicouleur 33 Ces méthodes fonctionnent bien pour réaliser des fonctionnalisations simples, mais sont limitées dans la précision du contrôle spatial complexe des concentra-tions de protéines, car elles ne permettent pas un contrôle able des pressions d'injection des solutions.

Ici, nous présentons une méthode baptisée  microcontat printing multi-couleur  (MCµCP) (par extension de l'acronyme µCP) qui a été développée en étroite collaboration avec Cécile Crozatiez. Elle permet d'imprimer des motifs de plusieurs compositions simultanément sur une surface et plus particulièrement d'imprimer des motifs de protéines dont la composition suit un gradient de concentration de surface d'une combinaison de molécules. Pour parvenir à ce résultat, le MCµCP utilise un tampon de µCP qui est encré par un réseau de canaux microuidiques. Les structures microuidiques de ce réseau sont conçues pour avoir des canaux indépendants qui permettent d'acheminer les liquides jusqu'aux motifs à encrer et d'adsorber le contenu de diérentes solutions de molécules à diérents endroits du tampon. L'assemblage réversible des canaux sur le tampon est obtenu en utilisant la technique de micro-aspiration présentée au chapitre précédent.

En outre, l'utilisation de la microuidique pour l'encrage permet de contrôler des ux de liquides de compositions complexes contenant des gradients spatiaux de concentration [28]. En eet, comme les ux dans les micro-canaux sont lami-naires, les solutions circulantes juxtaposées ne se mélangent que par diusion. En faisant circuler parallèlement diérentes solutions dont la composition suit un gradient de concentration d'une certaine molécule, on peut conserver un gra-dient important sur de longues distances. Ces gragra-dients dans le volume de la solution circulée se traduisent par l'adsorption sur le tampon de gradient de concentration de surface des molécules concernées (gure 3.3).

Tampon encré Transfert Motifs Microcontact printing

Entrées Sortie

Aspiration

Tampon encré Transfert Motifs Microcontact printing Entrées Sortie Canal d'encrage Aspiration

A

B

Figure 3.3  Schema de principe du microcontact princting multicouleur. A) Plusieurs molécules peuvent être utilisées pour encrer les motifs sur le tampon. B) Grâce aux propriétés laminaires des ux dans les microcanaux, les motifs peuvent être encrés avec des gradients de concentrations.

34 Chapitre 3. Fabrication de motifs de protéines Méthode

Solutions d'encrage : Les solutions d'encrage ont été préparées à partir de d'albumine de sérum bovin (BSA, Sigma), d'albumine de sérum bovin conjugué à un marqueur FITC (BSA-FITC, Sigma) et d'albumine de sérum bovin conjugué à un marqueur Cy3 (BSA-Cy3). Cette dernière protéine a été obtenue par conjugaison de BSA avec le uorochrome Cy3 (voir annexe B.3). La concentration utilisée était 10 µg/mL dans un tampon PBS.

Fabrication et utilisation des dispositifs : Les canaux des dispositifs en PDMS de 10 µm de haut ont été réalisés par lithographie molle classique (cf. annexe B.2). Les dispositifs ont été utilisés comme décrit au paragraphe précédent et les liquides injectés à l'aide d'un pousse-seringue.

µCP : Après encrage du tampon, le dispositif était désassemblé, le tampon rincé dans du PBS, puis séché dans un ux d'azote. Le transfert de la protéine sur le substrat était réalisé en appliquant le tampon sur la lame de verre pendant 10 s. Pour nir, la lame de verre était vigoureusement rincée à l'eau déionisée pour enlever les protéines mal adsorbées et les résidus de sel.

En utilisant cette méthode, nous avons encré plusieurs types de tampons avec un double gradient de protéines uorescentes BSA-FITC(vert)/BSA-Cy3(rouge). Comme on peut le voir sur la gure 3.4, des disques de 5 et 20 µm de diamètre (gure 3.4B et 3.4C), ainsi que des lignes de 1 µm de large (gure 3.4D) ont été transférées, créant une impression de motifs dont la composition varie progres-sivement d'une molécule à l'autre, sur une distance de 500 µm.

A B C

Figure 3.4  Exemple de motifs réalisés par microcontact printing multicouleur. A) Tampon contenant un réseau de plot de 50 µm de diamètre. B) Réseau de plot de 5µm de diamètre. C) Lignes de 5 µm de large. Les barres représentent 100 µm.

La première application de cette technique réside dans la fabrication de dié-rents substrats complexes pour l'étude de la croissance cellulaire, leur motilité et leur diérenciation. Les motifs contenant des gradients de protéines permettent de déterminer le rôle de ces protéines dans la signalisation spatiale [37], de même l'utilisation de fonctionnalisation de surface bien dénie en termes de motifs et de composition permet de générer et de contrôler des surfaces à l'échelle de la cellule. Par exemple, les propriétés de chémo-attraction de diérentes protéines peuvent être étudiées sur la croissance des axones sur des lignes semblables à celles montrées sur la gure 3.4 et la construction de réseaux de neurones de topologie contrôlée est envisageable en guidant la croissance des axones d'un groupe de cellules à l'autre par des gradients de facteur de croissance axonale.

3.4. Application à la culture cellulaire 35