2.5 Conclusion
Nous avons proposé dans ce chapitre une méthode pratique et robuste pour réaliser un assemblage réversible de dispositifs micro uidiques, basé sur la micro-aspiration. Un modèle analytique simple a été présenté en considérant la géo-métrie du système, fournissant une explication de la nature des phénomènes mécaniques mis en jeu à travers l'expression de la pression limite applicable dans un canal scellé par micro-aspiration avant qu'une fuite ne puisse appa-raître. Des simulations FEM ont permis de con rmer la phénoménologie du modèle analytique et d'avoir des données plus nes sur le comportement des dispositifs. Elles ont notamment abouti à l'identi cation d'un rapport d'aspect optimal de 0,75 pour le mur séparant le canal de travail du réseau d'aspiration. Les premières données expérimentales récoltées en mesurant le déplacement de la surface du dispositif ont permis de valider l'hypothèse de la déformation du réseau d'aspiration. Et nalement, la pression maximale applicable dans les ca-naux micro uidiques a été mesurée dans diérentes conditions et s'accorde avec le modèle et les simulations.
La méthode proposée pourrait être utile à certaines applications, aussi bien pour des traitements micro uidiques que pour des fonctionnalisations de surface. Le chapitre en présentera certains exemples choisis pour la fabrication de motifs sur des surfaces solides.
Chapitre 3
Fabrication de motifs de
protéines
L
a fabrication de motifs de biomolécules est particulièrement délicate en com-paraison des autres matériaux. Leur fonction, ou activité biologique, est gé-néralement liée à leur conformation. Cette organisation interne est basée sur des liaisons faibles et se dénature facilement lorsque l'environnement de la molécule s'éloigne trop des conditions physiologiques. Les méthodes conventionnelles de fabrication de motifs et plus particulièrement les méthodes lithographiques sont très performantes en termes de résolution, de coûts et de cadence de production. Néanmoins, comme nous l'avons souligné dans l'introduction, elles nécessitent généralement l'utilisation de solvants non-aqueux et/ou de conditions extrêmes en termes de pression, température ou pH. Ces méthodes ne satisfont donc gé-néralement pas aux conditions nécessaires pour conserver intactes les fonctions des molécules biologiques. Des méthodes plus douces doivent êtreutilisées.Dans ce chapitre, nous présenterons des méthodes originales utilisant la mi-cro uidique pour déposer des motifs de protéines en utilisant les dispositifs à assemblage réversible assistés par micro-aspiration présentés au chapitre précé-dent.
3.1 Traitements de surface par assemblage
réver-sible
Les dispositifs à assemblage réversible permettent de fonctionnaliser des sur-faces par application directe du dispositif sur le substrat. Dans ce cas, un dispo-sitif est assemblé sur le substrat et des solutions de protéines sont circulées dans les micro-canaux ( gure 3.1A). Les molécules présentes dans les solutions s'ad-sorbent alors sur le substrat. Après désassemblage du dispositif et rinçage du substrat, des protéines sont déposées uniquement sur les surfaces précédemment situées sous les canaux ( gure 3.1B).
Cette technique peut être utilisée avantageusement dans diérentes con gu-rations :
1. Fonctionnalisation simple. La circulation de solutions dans les canaux assemblés réversiblement permet d'imprimer des motifs de plusieurs
28 Chapitre 3. Fabrication de motifs de protéines téines par adsorption sur la surface. Ce procédé a l'avantage d'être très simple mais nécessite des espaces vides entre les zones fonctionnalisées qui sont nécessaires à la dé nition des canaux.
2. Fonctionnalisations séquentielles. Plusieurs fonctionnalisations peuvent être réalisées séquentiellement à l'aide du même dispositif ou de dispositifs diérents. Pour ce faire, le dispositif est assemblé puis désassemblé à plu-sieurs reprises. Après chaque nouvel assemblage, une nouvelle protéine en solution est utilisée. Des zones connexes fonctionnalisées avec diérentes protéines peuvent alors être réalisées. Sur les zones de recouvrement des fonctionnalisations successives, l'équilibre dynamique de sorption des pro-téines permet un échange entre la surface et la solution qui aboutit à des zones contenant un mélange des protéines circulées successivement sur la surface. La gure 3.1C montre l'adsorption successive de BSA-FITC (vert) et de BSA-cy3 (rouge) à l'aide d'une série de canaux parallèles assemblés par micro-aspiration. On peut observer sur les zones de recouvrement des deux fonctionnalisations, la présence d'un mélange des deux types de pro-téines.
3. Fonctionnalisation à étape multiple et/ou avec prétraitement. Comme il est possible de faire circuler plusieurs liquides successivement dans les canaux, une fonctionnalisation nécessitant plusieurs étapes de chi-mie de surface peut être appliquée. La gure 3.1D montre le greage local et covalent d'une protéine uorescente BSA-cy3 en utilisant un protocole développé au laboratoire, adapté à la fonctionnalisation des canaux mi-cro uidiques en verre et en PDMS (Les détails du protocole sont donnés en annexe ??). Ce protocole, qui nécessite de faire circuler trois réactifs successivement avec des étapes de rinçage entre chaque réactif, permet de greer les protéines de manière covalente sur le substrat, permettant une meilleur adhésion cellulaire sur la surface en comparaison d'un protocole n'impliquant qu'une simple adsorption de la protéine [219].
D'autre part, comme la surface n'est pas altérée sur la zone du RCC, un prétraitement de la surface peut être conservé sur cette zone pour une utilisation ultérieure. Le protocole utilisé pour fonctionnaliser la surface présenté en gure 3.1D débute par un traitement plasma de toute la surface du substrat. Comme celle-ci n'est pas altérée dans la zone du RCC lors de la fonctionnalisation, cette activation de la surface est utilisée dans un deuxième temps pour sceller irréversiblement un canal en PDMS sur le substrat localement fonctionnalisé. Ainsi, seule une petite bande sur le verre est fonctionnalisée dans le canal nal.
4. Fonctionnalisation micro uidique complexe. En utilisant un dispo-sitif micro uidique réversible plus complexe mettant en contact plusieurs liquides, il est possible d'obtenir des gradients spatiaux de concentration de surface de diérentes protéines. Cette approche sera abordée dans la section 3.3.
3.1. Traitements de surface 29
A B
C D
Canal
Figure 3.1 Fonctionnalisations de surface réalisées avec des assemblages ré-versibles. A) La barre représente 100 µm. B) La barre représente 200 µm. C) La barre représente 100 µm. D) La barre représente 200 µm.
Méthode
Fonctionnalisation simple. (Figure 3.1B). Un canal simple de 200 µm de large et 10 µm de haut a été assemblé par micro-aspiration sur une lame de verre (Menzel) sans prétraitement particulier. Une solution de 100 µg/mL de BSA-FITC est ensuite circulée pendant 1 min. Après retrait de la couche de PDMS, la lame est rincée au PBS 1x puis à l'eau DI.
Fonctionnalisation double. (Figure 3.1C). Une série de canaux de 100 µm de large et 10 µm de haut a été assemblée par micro-aspiration sur la lame de verre (Menzel). Dans un premier temps, une solution de 100 µg/mL de BSA-FITC est circulée pendant 1 min. Après retrait de la couche de PDMS, la lame est rincée au PBS 1x et à l'eau DI et le dispositif nettoyé à l'isopropanol et à l'eau DI. Après séchage du substrat et du dispositif sous un ux d'azote, le même dispositif est assemblé une seconde fois sur le substrat de manière à ce que la nouvelle direction des canaux micro uidiques soit perpendiculaire à la direction appliquée lors de la première fonctionnalisation. Une nouvelle solution de 100 µg/mL de BSA-cy3 est circulée dans les canaux pendant 1 min. Finalement, le dispositif est à nouveau désassemblé et le substrat rincé une dernière fois.
Fonctionnalisation locale et covalente d'un canal scellé irréversible-ment. (Figure 3.1D). Le substrat en verre est tout d'abord traité par plasma air (500 mTorr à puissance maximum pendant 2 min dans un Harrick plasma cleaner), puis le protocole de fonctionnalisation décrit en annexe ?? est ap-pliqué dans un canal de 200 µm de large assemblé par micro-aspiration. Ce protocole, développé en collaboration avec le Dr. Zhiling Zhang, permet de greer de manière covalente des protéines à la surface des canaux micro ui-diques en verre et en PDMS. Une fois le protocole appliqué et la couche de PDMS décollée (on a pris soin de rincer, vider et sécher le canal auparavant), une couche de PDMS classique contenant un canal de 200 µm de large et préalablement traité au plasma (30 s à 500 mTorr et puissance maximale) est collée irréversiblement sur la surface. Pour activer la réaction, le dispositif est ensuite chaué 1 h dans une étuve à 80◦C.
30 Chapitre 3. Fabrication de motifs de protéines En comparaison des méthodes capillaires [8], ou utilisant une faible pression [32] ou un pression négative [9, 10] qui permettent également des assemblages réversibles, l'assemblage par micro-aspiration permet une pression d'injection plus élevée. Ceci rend la méthode plus robuste et permet un contrôle plus n des débits dans les micro-canaux. D'autre part, et comme nous le verrons plus précisément dans la section suivante, le vide présent autour des canaux micro- uidiques dégaze le PDMS du dispositif, ce qui évite l'apparition de bulles qui peuvent être très problématiques lors de l'utilisation de faibles pressions d'injec-tion. Ces avantages font de la micro-aspiration un outil pertinent pour modi er la chimie de surface d'un substrat avec une haute résolution.
Néanmoins, comme la continuité des ux doit être respectée, les motifs réa-lisés doivent êtres connexes. Whitesides et al. ont proposé, pour pallier ce pro-blème, d'utiliser des canaux micro uidiques à 3 dimensions. Mais leur fabrication est complexe en comparaison des méthodes lithographiques classiques. Par une autre approche, le microcontact printing permet d'imprimer n'importe quel mo-tif par simple mise en contact de la surface avec un tampon. Cette méthode ne permet pas réellement de faire de la chimie de surface et est limitée au transfert d'une seule molécule simultanément, mais nous montrerons que cette technique peut être combinée à un assemblage réversible pour pro ter des avantages des deux techniques.